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光肩星天牛Anoplophora glabripennis（Motschulsky）和星天牛 Anoplophora chinensis（Forster）属鞘翅 目 Coleoptera,天牛科 Cerambycidae,沟胫天牛亚科Sbufamily Lamiinae,星天牛属Anoplophora,是世界范围内重要的检疫性害虫。两者有时同域发生、危害共同寄主,且共享雄性释放的聚集信息素。嗅觉系统在昆虫生长、寄主定位、求偶,躲避天敌等生命过程中发挥着重要作用,阐明昆虫的化学通讯机理,有助于我们了解昆虫之间及昆虫与寄主植物之间的相互关系,为设计新的害虫防治方法提供理论依据。本研究以光肩星天牛和星天牛为研究对象,对两种星天牛嗅觉感受过程中的关键蛋白的表达模式和功能进行了探讨。其主要研究结果如下:1、鉴定了光肩星天牛和星天牛嗅觉相关蛋白基因在光肩星天牛触角转录组中共鉴定了 124个嗅觉相关蛋白基因。包括42个气味结合蛋白（Odorant binding proteins,OBPs）、12 个化学感受蛋白（Chemosensory proteins,CSPs）、37 个气味受体（Odorant receptors,ORs）、4 个离子型受体（Ionotropic receptors,IRs）、11个味觉受体（Gustatory receptors,GRs）、1 个气味降解酶（Odorant-degrading enzyme,ODE）、14 个信息素降解酶（Pheromone edegradingenzymes,PDEs）和3个神经元膜蛋白（Sensory neuron membrane protein,SNMPs）。整合本研究数据及后期报道的基因组数据,共得到61条OBPs并统一命名（AglaOBPl-61）。系统发育分析结果显示,15条AglaOBPs属于触角结合蛋白Antennae-binding proteins（ABPII）亚族,10 条 AglaOBPs 属于“Classic OBP”亚族;29 条 AglaOBPs 属于“Minus-C OBP”亚族;AglaOBP51序列具有8个保守的半胱氨酸,且第六个半胱氨酸后紧跟一个保守的脯氨酸,属于“Plus-C OBP”。AglaOBP45和AglaOBP46与云斑天牛Batocera horsfieldi PBP2有较高的序列相似性,注释为性信息素结合蛋白（Pheromone binding proteins PBPs）。在星天牛触角转录组数据中共鉴定了 46条OBPs,16条CSPs,44条ORs,19条GRs,23条IRs和3条SNMPs。23条OBPs序列具有完整的开放阅读框且N末端有信号肽,为全长序列。系统发育树结果表明,AchiOBP3属于“Plus-C OBP”;c27344.graphc0 和 c25366.graphc0 和其他鞘翅目昆虫 PBPs 聚为一支。12条CSPs为两种星天牛的同源基因,4条CSPs在星天牛触角中特异表达。2、分析了两种星天牛嗅觉相关蛋白基因mRNA水平的组织表达谱通过半定量RT-PCR和荧光定量qRT-PCR分别对两种星天牛雌雄两性6个组织中,所有CSPs的表达谱进行分析。两种星天牛绝大多数CSPs在多种嗅觉组织中高表达,表明它们参与几乎所有嗅觉组织的嗅觉识别过程。光肩星天牛AglaCSP7,AglaCSP8,AglaCSP9和AglaCSP11在触角中有最高表达,AglaCSP7和AglaCSP9在触角中的表达水平显著高于其他组织。AglaCSP3,AglaCSP6和AglaCSP12偏向表达在下颚须中。星天牛AchiCSP10和AchiCSP12在触角中的表达高于其他组织,AchiCSP10在星天牛雄性触角中表达最高。61个光肩星天牛OBPs的表达谱分析结果表明:12个AglaOBPs在光肩星天牛触角中有表达较高,其牛7 个 AglaOBPs（AglaOBP3、AglaOBP33、AglaOBP41、AglaOBP45、AglaOBP47、AglaOBP48 和 AglaOBP53）几乎在触角中特异性表达。表明这些OBPs在光肩星天牛嗅觉识别中起到了关键作用,可能作用于信息素和寄主植物挥发物识别以及产卵场所的定位;AglaOBP45和AglaOBP46在触角中均有较高表达,其中AglaOBP45在触角中的表达的水平比其他组织高200倍。3、纯化得到了 AglaOBP45和AglaOBP46蛋白并明确其在蛋白水平的组织表达对光肩星天牛两种候选PBPs基因AglaOBP45和AglaOBP46进行克隆和序列分析,结果显示:AglaOBP45、AglaOBP46全长开放阅读框（ORF）分别由408和411个核苷酸组成,编码135个和136个氨基酸残基。SDS-PAGE检测发现光肩星天牛重组蛋白AglaOBP45和AglaOBP46主要存在形式为包涵体,进一步破碎、复性、纯化后,得到大小分别约为12kD的单一条带,与预期结果一致。Western blot分析表明,AglaOBP45在雌、雄虫触角中显著表达,且蛋白条带深浅程度表明雄虫触角表达高于雌虫触角;AglaOBP46在雌雄虫触角、足、下颚须中都有表达,与mRNA水平的表达结果基本一致。4、构建了 AglaOBP45和AglaOBP46的三维结构并分析其与气味化合物的分子对接对AglaOBP45和AglaOBP46进行同源建模发现,两者均有6个α-螺旋,且这些螺旋和连接它们的回折构成了其三维结构。Procheck、Verify3D和ERRAT的评估分值均显示AglaOBP45和AglaOBP46的模建结构质量较高。选择34种光肩星天牛寄主植物挥发物及7种信息素物质分别与两种蛋白进行模拟对接。结果显示,AglaOBP45和AglaOBP46与配体分子的结合自由能的分布范围较窄。AglaOBP45与光肩星天牛接触性信息素组分（Z）-9-二十三碳烯、（Z）-9-二十五碳烯的自由结合能最小,其次是α蒎烯。AglaOBP46与长叶烯、柠檬烯、十二烷醇的自由结合能最小,说明蛋白与这些配体间的亲和力最高。蛋白质与化合物的结合模式分析表明,结合腔主要由疏水性残基组成,这利于疏水性气味分子的结合。此外,氢键、范德华力和疏水作用会影响AglaOBP45和AglaOBP46与气味分子的亲和度。5、明确了 AglaOBP45和AglaOBP46与配体分子的结合能力选择分子对接中与AglaOBP45和AglaOBP46有较高亲和度的配体分子,利用荧光竞争结合实验,进一步分析其结合能力。配体分子主要包括2种光肩星天牛雄虫释放的聚集信息素成分,5种雌虫释放的接触性信息素组分,10种醇类、7种烯类、4种醛类和4种酯类。结果表明,AglaOBP45和AglaOBP46均不能与聚集信息素成分结合,且AglaOBP46也不结合接触性信息素成分。而AglaOBP45只与光肩星天牛雌虫接触性信息素成分中的（Z）-9-二十三碳烯和（Z）-9-二十五碳烯有效的结合,推测其参与了这两种雌虫接触性信息素成分的识别。同时,AglaOBP45与寄主植物挥发物罗勒烯和莰烯有特别强的结合能力,结合常数分别为1.02μmol/L和1.96μmol/L,推测AglaOBP45也是识别两种物质的重要蛋白。AglaOBP46与十二烷醇结合能力最强,结合常数为0.74μmol/L,其次是苯甲醇和2-戊醇,结合常数分别为0.82μmol/L和2.12μmol/L。综合分析,我们认为AglaOBP45和AglaOBP46均参与光肩星天牛嗅觉反应,但AglaOBP46不与其信息素物质结合。AglaOBP45主要在触角中表达,可以与雌性释放的接触性信息素结合,参与了光肩星天牛接触性信息素的识别。