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目的肝癌是我国常见恶性肿瘤之一,容易早期发生侵袭转移,这也是其术后复发、疗效差的主要原因。肿瘤微环境(包括氧浓度、细胞外基质、免疫细胞、间质细胞等)是影响肿瘤转移的重要因素,其中缺氧是许多恶性肿瘤(如肝癌、前列腺癌,胰腺癌等)微环境的一个显著特点,缺氧越严重提示肿瘤的预后越差。癌细胞主要通过上皮间质转化获得侵袭能力,进而突破基底膜发生转移。本课题在研究缺氧对肝癌细胞EMT的诱导作用的基础上,进一步研究缺氧环境中Netrin-1促进肝癌细胞EMT的作用,并对其下游作用机制进行了深入探讨。方法通过1%O2低氧培养建立人肝癌细胞物理缺氧模型,缺氧条件下无血清培养72小时,倒置显微镜观测肝癌细胞在缺氧条件下的形态改变,应用Western blot方法检测上皮细胞标志蛋白E-cadherin、间质细胞标志蛋白Vimentin的表达变化,罗丹明标记的鬼笔环肽检测细胞内骨架重组,用Transwell检测缺氧肝癌细胞迁移、侵袭能力。ELISA检测缺氧肝癌细胞分泌的Netrin-1,免疫荧光检测Netrin-1在缺氧肝细胞中的表达。构建针对Netrin-1 mRNA的干扰质粒pshRNA-Netrin-1及阴性对照质粒pGensil-2,测序鉴定重组体。干扰质粒转染肝癌细胞细胞,G418筛选稳定转染细胞株,RT-PCR和Western blot检测Netrin-1表达的变化。缺氧条件下检测转染肝癌细胞形态改变、标志蛋白蛋白改变和功能改变。构建Netrin-1真核表达质粒,酶切鉴定,G418筛选稳定转染细胞株。观测过表达Netrin-1对肝癌细胞形态和迁移、侵袭能力的影响。同时给予Netrin-1蛋白作用肝癌细胞观测其对肝癌细胞形态和迁移、侵袭能力的影响。免疫荧光观测p-Akt在缺氧肝癌细胞中的表达,Western blot检测缺氧条件下PI3K/Akt通路信号分子的表达,观测PI3K抑制剂LY294002对缺氧诱导肝癌细胞EMT的影响。结果在缺氧条件下,肝癌细胞由连接紧密的上皮样变成连接松散的纺锤体样,胞体狭长,细胞分散,失去细胞间连接。Western blot结果显示,缺氧条件下E-cadherin表达下降甚至消失,Vimentin表达显著增加。鬼笔环肽检测显示,常氧条件下细胞包内F-actin主要位于细胞周边,可见纤细的中间丝,缺氧培养后可见F-actin骨架重组,细胞周边的F-actin重新排列成较粗的中间丝(紧张丝),紧张丝在细胞内平行排列拉伸细胞形态。细胞迁移实验结果显示,缺氧显著促进HepG2细胞迁移能力(P<0.01),侵袭实验结果与迁移实验结果一致。肝癌细胞稳定转染pshRNA-Netrin-1后,Netrin-1表达显著下降,抑制率达72.79%%±5.11%。转染pshRNA-Netrin-1肝癌细胞显著抑制缺氧诱导肝癌细胞形态改变,同时抑制Vimentin表达,增加E-cadherin表达,对缺氧促进肝癌细胞迁移能力有显著抑制作用,透膜细胞数(314±21)个较对照组(386±23)个显著降低(P<0.05),侵袭实验结果与迁移实验结果一致。常氧条件下,转染Netrin-1真核表达质粒和用500ng/ml Netrin-1作用肝癌细胞,都观测到细胞形态,呈纺锤体样,细胞迁移、侵袭能力显著增加。PI3K/Akt信号通路在缺氧条件下激活,p-Akt、NF-κB、Twist表达显著增加,在LY 294002的作用下,缺氧诱导的细胞形态改变和E-cadherin减少均受显著抑制,LY 294002抑制PI3K信号能阻断缺氧诱导的肝癌细胞EMT。结论缺氧环境中,Netrin-1激活PI3K/Akt信号通路进而诱导肝癌细胞上皮间质转化,可能促进肝癌的侵袭转移。深入研究Netrin-1作用的分子机制和体内对侵袭转移的影响,可能为抑制肝癌转移的治疗提供实验依据。