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目的:探讨R18多肽联合亚低温通过抑制细胞自噬对颅脑创伤(Traumatic Brain Injury,TBI)后神经元的保护作用及机制。方法:1)原代分离培养E18-19 SD大鼠皮质层神经元细胞并将细胞分组:对照组和谷氨酸诱导组。用免疫荧光对原代分离的神经元进行鉴定;用MTS检测细胞谷氨酸诱导72h后细胞的活力改变。采用落体打击的方法建立SD大鼠TBI模型,对照组不予以撞击。在模型建立72h和12d后剥离大鼠脑组织并采用Nissl染色来检测神经元细胞的损失;从模型建立后第一天开始采用钉板平衡木行走测试对大鼠的行为学进行检查;同时对大鼠神经功能缺损进行评分(modified neurological severity scores,mNSS);2)将细胞分为五组:分别为对照组、谷氨酸处理组、亚低温处理组(32.0?0.5℃)、R18多肽处理组以及亚低温联合R18多肽处理组。对照组不施加任何处理因素,谷氨酸处理组为用谷氨酸处理并诱导神经元细胞损伤组,亚低温处理组、R18多肽处理组以及亚低温联合R18多肽处理组为在谷氨酸诱导神经元细胞损伤时分别施加对应的处理因素组,同时,R18多肽设置四个浓度梯度(分别为0.2?M、0.5?M、1?M和2?M)。用MTS实验检测72h后各组的细胞活力;采用Fura-2 AM法测量各组细胞内钙离子浓度的变化;western blot法检测各组细胞内Beclin-1、LC3、caspase-3和Bcl-2蛋白表达的改变;RT-qPCR法检测各组细胞内Beclin-1、LC3、caspase-3和Bcl-2 mRNA水平的改变;3)将SD大鼠分成5组,每组8只,分别为对照组、模型组、亚低温治疗组、R18多肽治疗组以及R18多肽联合亚低温治疗组。对照组为正常未造模的大鼠,模型组为未进行治疗的TBI模型鼠,亚低温治疗组、R18多肽治疗组以及R18多肽联合亚低温治疗组为建立TBI模型后分别施加治疗的大鼠,其中亚低温治疗是采用冰袋物理降温的方法保持大鼠全身亚低温,R18多肽治疗是在TBI模型建立30min后经右侧颈静脉注射人工重组的R18多肽(300nmol/kg)。治疗72h后,对各组大鼠进行mNSS评分;采用干/湿比重法测定脑组织中含水量。脑组织HE染色和Bielschowsky’s银染色:在治疗后72h,在对照组和TBI模型组中随机选取3只大鼠,麻醉后取脑组织进行HE染色,同时,取脑组织切片进行Bielschowsky’s银染色来评估轴索损伤。免疫组化法(Immunohistochemistry,IHC)检测各组大鼠脑组织中Beclin-1和LC3的表达;分离大鼠海马组织,并用Tunnel法检测各组大鼠海马组织中细胞凋亡情况。结果:1)免疫荧光显示Tubulin染色阳性,所分离的细胞为神经元细胞。经谷氨酸诱导后细胞活力明显下降(P<0.01),说明神经元细胞在谷氨酸诱导下发生了损伤。Nissl染色显示:TBI模型建立72h后TBI组脑组织神经元数量明显下降(5542/mm~3vs 4124/mm~3,P<0.01);12天后差距缩小(5613mm~3 vs 5109mm~3,P<0.01)。行为学检查显示:在TBI建立后12天内模型组大鼠在平衡木上的滑落次数高于对照组;行为学评分显示在TBI模型建立后3d后mNSS评分最高,随着时间的推移,逐渐下降;2)谷氨酸处理神经元细胞后,细胞的活力明显下降(P<0.01);与谷氨酸处理组相比,亚低温处理组和R18多肽处理组的细胞活力升高(P<0.05),并且,随着R18多肽浓度的升高,细胞活力也逐渐升高(P<0.05),R18多肽联合亚低温处理组细胞活力同样随着R18多肽浓度的升高而升高(P<0.05)。Fura-2 AM实时监测实验表明与对照组相比,谷氨酸处理组细胞内钙离子浓度显著升高,亚低温处理组、R18多肽处理组以及R18多肽联合亚低温处理组均降低了钙离子内流,且下降的程度为R18联合亚低温(29)R18多肽(29)亚低温,并且,随着R18多肽浓度的升高,钙离子内流下降的程度越大;荧光显微镜观察到的结果与实时监测的结果一致。谷氨酸诱导神经细胞损伤后细胞中自噬相关蛋白Beclin-1和LC3表达升高,凋亡相关蛋白caspase-3表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降;亚低温、R18多肽以及R18多肽联合亚低温降低了Beclin-1、LC3和caspase-3的表达和促进了Bcl-2的表达,且R18多肽联合亚低温处理比单独R18多肽处理以及亚低温处理的效果更明显;3)TBI模型后大鼠神经功能受损,mNSS评分升高(P<0.01),而TBI后采用亚低温和R18多肽进行治疗后神经功能得以恢复,mNSS评分降低(P<0.05),且R18多肽联合亚低温治疗组的mNSS评分最低(P<0.05)。TBI模型后大鼠脑组织中出现出血灶,细胞排列紊乱;对照组大鼠脑组织中胼胝体显得光滑,少突胶质细胞的细胞核排列规则且平行于轴突排列,而TBI后大鼠脑组织中胼胝体结构紊乱,少突胶质细胞的细胞核排列不规则且取向混乱。与对照组相比,TBI后大鼠脑组织中含水量显著升高(86.20?1.21%vs 71.12?1.32%,P<0.05),与TBI组相比,亚低温治疗组(80.34?0.91%)、R18多肽治疗组(76.23?0.87%)和R18多肽联合亚低温治疗组(73.02?1.09%)大鼠脑组织中含水量均降低(P<0.05)。IHC显示TBI后脑组织中Beclin-1和LC3表达均升高,与TBI组相比,亚低温治疗组、R18多肽治疗组以及R18多肽联合亚低温治疗组均降低了Beclin-1和LC3的表达,且联合治疗组的效果最明显。Tunnel凋亡检测实验表明TBI后海马组织中细胞凋亡显著升高(P<0.01),与TBI组相比,亚低温治疗组、R18多肽治疗组以及R18多肽联合亚低温治疗组均抑制了细胞凋亡(P<0.05),且联合治疗组的抑制效果最显著(P<0.01)。结论:亚低温和R18多肽联合治疗可以抑制谷氨酸诱导的神经元细胞损伤,可能是通过升高细胞活力、抑制钙离子内流以及抑制细胞自噬和细胞凋亡的过程来发挥保护作用的。亚低温和R18多肽联合治疗可以保护TBI模型大鼠颅脑免受创伤,可能是通过恢复神经功能、减轻脑水肿的程度、抑制神经元细胞自噬发挥保护作用的,且联合治疗的效果优于单独治疗。