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微生物燃料电池（Microbial fuel cell，MFC）是上世纪80～90年代迅速发展起来的一种能源获取方式，具有产物洁净、条件简单等特点，因此也越来越受到科学家们的重视。目前，有关MFC的研究主要集中在电极材料的改进、运行参数的优化以及阳极菌株的选择和优化上，也有研究者开始利用基因工程技术对产电微生物进行改造，但这方面的研究相对较少。在众多的阳极菌中，铜绿假单胞菌由于其良好的产电性能而获得越来越多的应用，其产电机制是通过合成绿脓素这类电子中介体来传递电子。前人有研究证明甲基转移酶基因phzM是铜绿假单胞菌中绿脓素合成途径的关键基因，并对菌株的产电性能有一定的影响。phzM缺陷型的铜绿假单胞菌不能合成绿脓素，同时菌株也失去了产电能力。 本文以铜绿假单胞菌PAO1（Pseudomonas aeruginosa PAO1）为研究对象，通过过表达甲基转移酶基因phzM获得一株高产绿脓素的重组铜绿假单胞菌，并在典型的单室MFC中对其产电性能进行研究，首次揭示了增加内源性电子传递体的产量对微生物燃料电池产电性能的影响及其机制。具体成果如下所示: 1.选用E.coli和Pseudomonas aeruginosa PAO1（以下简称PAO1）的穿梭质粒pBBR1MCS-5作为表达载体，将菌株Pseudomonas aeruginosa PAO1的甲基转移酶基因phzM连接到pBBR1MCS-5上，构建重组表达质粒pBBR1MCS-5-phzM，将该重组质粒通过电转化方式转入Pseudomonas aeruginosa PAO1并表达，得到重组菌Pseudomonas aeruginosa PAO1-phzM（以下简称PAO1-phzM）。实验测得重组菌PAO1-phzM的甲基转移酶活性为4.77±0.03 U/mg-1蛋白，比原始菌PAO1提高了3倍，证明该酶的编码基因phzM在重组菌PAO1-phzM中过表达成功。 2.利用响应曲面法对重组菌phzM基因的诱导表达条件进行了优化。结果显示，重组菌在诱导OD600为3.7，诱导温度为37℃，诱导时间为14h时甲基转移酶活性最高，达到6.21±0.05 U/mg-1蛋白，相比较于未优化条件酶活提高了31％。但考虑到菌体在诱导14h，即培养时间为17h（菌体从OD600=0长到OD600=3.7时需要3h）时已进入衰亡期，菌体活力大大下降，不利于MFC中的生物膜形成，从而影响MFC的运行。因此在优化的诱导表达条件下制作了重组菌的生长曲线并建立了利用高效液相色谱(HPLC)精确测定绿脓素含量的方法。结果显示，重组菌PAO1-phzM诱导14h时绿脓素含量为46.27±0.06μg/mg湿菌体，但此时菌体已进入生长的衰亡期，菌体活力较弱;而诱导10h（实际培养时间为13h）时的绿脓素含量为41.23±0.11μg/mg湿菌体，与14h差异较小，但此时菌体处于稳定期的中前期，相比衰亡期活力较大，因此将诱导的时间确定为10h。 3.在上述确定的优化条件下，检测了重组菌PAO1-phzM与原始菌PAO1培养13h时的吩嗪物质含量。结果显示，原始菌绿脓素含量为15.89±1.17μg/mg湿菌体，重组菌是其2.59倍，表明过表达甲基转移酶基因phzM能够较大效率的提高菌株绿脓素合成量。同时发现，重组菌吩嗪类物质的合成量也有相应改变。与原始菌相比，1-羟基吩嗪(1-OH-PHZ)提高了2.13倍，吩嗪-1-羧酸(PCA)提高了1.64倍，说明对phzM基因过表达后，能够改变重组菌吩嗪类物质合成的代谢流。 4.分别将重组菌PAO1-phzM和原始菌PAO1接入MFC并测定其产电性能。MFC运行稳定后，以原始菌PAO1为接种源的MFC（以下简称PAO1-MFC）的最高输出电压为0.17V左右，而以重组菌PAO1-phzM为接种源的MFC(以下简称PAO1-phzM-MFC)的最高输出电压为0.34V左右，重组菌的电压是原始菌PAO1的2倍。经计算，PAO1-MFC的相应电流密度为0.24A/m2，PAO1-phzM-MFC的相应电流密度为0.49A/m2，重组菌是原始菌的2倍。结果表明，过表达甲基转移酶基因phzM后能够显著提高重组菌的产电性能。 5.在此基础上进一步监测了PAO1-MFC和PAO1-phzM-MFC的极化曲线、功率密度曲线和循环伏安图(CV)等电化学参数。根据极化曲线计算两组MFC总内阻，结果显示重组菌总内阻为1159Ω，原始菌总内阻为2113Ω，推断重组菌中的高绿脓素产量提高了细菌与阳极电子传递的能力，带动更多的电子流动到电极上，因此降低了MFC的活化内阻和欧姆内阻。同时根据功率密度曲线比较了两组MFC的最大功率密度，结果显示，PAO1-MFC的最大功率密度为42.53mW/m2，PAO1-phzM-MFC的最大功率密度为166.68mW/m2，重组菌是原始菌的3.92倍。利用循环伏安图(CV)比较了两组MFC反应室内的氧化还原物质情况，结果显示两组MFC反应室内都能够产生一种氧化还原物质，经与绿脓素标准品的CV图比对得知该物质为绿脓素，且PAO1-phzM-MFC中绿脓素的含量是PAO1-MFC的2.5倍，与HPLC的检测结果基本一致。表明绿脓素含量的提高是导致MFC产电性能提高的关键因素。 综上所述，在Pseudomonas aeruginosa PAO1中过表达甲基转移酶基因phzM,能够改变重组菌吩嗪类物质合成的代谢流，促进重组菌株合成更高浓度的绿脓素，并以绿脓素作为电子中介体高效传递电子，同时降低了MFC的总内阻，最终导致MFC的产电性能显著提高。