常染色体显性多囊肾病(Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease, ADPKD)是一种常见的肾脏显性遗传疾病,由PKD1或者PKD2基因突变引起,发病率大约1/400-1/1000。病理症状主要表现为肾脏中产生充满液体的囊泡,并且随着病情的发展,这些囊泡的数量会逐渐增多,体积也会逐渐增大。大约一半的ADPKD患者在50～60岁期间会产生终末期肾病。到目前为止,除了肾脏透析或者肾脏移植,仍然没有药物或者治疗方法能够治愈ADPKD.通过对小鼠ADPKD疾病模型的研究,人们对于ADPKD的发病机理有了比较深刻的认识。但是,小鼠ADPKD模型还没有能够帮助人类寻找到一种有效的治疗药物或者治疗方法。相对于小鼠和人类在肾脏结构等方面的较大差异,小型猪和人类的肾脏具有更高的相似性,这使小型猪成为构建肾脏疾病模型的极佳实验动物。因此,本研究尝试建立ADPKD的小型猪模型,为研究ADPKD致病机理和开发治疗手段提供一种更能真实反映人类ADPKD的新模型。SBM小鼠是一种在肾脏过表达c-Myc基因的ADPKD模型。以此为基础,本研究尝试通过在小型猪肾脏中过表达c-Myc基因来建立ADPKD模型。使用小鼠肾脏特异表达基因Ksp-cadherin的启动子和猪c-Myc基因的cDNA,构建了pKsp-c-Myc-b转基因载体,然后通过体细胞核移植得到了7头c-Myc转基因猪。其中,3头转基因猪出生后很快死亡,尸检没有发现肾脏有明显病变。Western Blot显示c-Myc基因在3号转基因猪的脑、心、肝、肾都有明显过表达。3号转基因猪的肾脏免疫组化染色结果显示：肾脏管腔上皮细胞的c-Myc基因明显过表达,但是除了管腔略微扩张,没有出现囊泡等明显病理症状。在存活的转基因猪生长到1、4、6月龄时,测定转基因猪和同窝野生型猪的血尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)：1月龄时转基因猪的BUN明显高于野生型猪,但是4、6月龄时没有显著差异；转基因猪和野生型猪的Scr在三个时间点都没有明显差异。在10号转基因猪生长到13月龄时,取其肾脏进行检测：WesternBlot显示其肾脏中c-Myc、Erkl/2总蛋白和磷酸化Erkl/2表达水平和野生型猪没有差异,H&E染色也没有发现肾脏存在明显病变。因此,pKsp-c-Myc-b转基因小型猪未能表现出常染色体显性多囊肾病的病理症状,说明SBM小鼠有其独特性。为了在小型猪上建立含有PKD2错义突变(亚等位基因)的ADPKD疾病模型,本研究筛选了针对猪PKD2基因第9号外显子的7对TALEN,尝试将小型猪polycystin-2蛋白的第658号亮氨酸突变为色氨酸。通过测序和EcoRV酶切两种方法证明：T-93、T-931和T-934三对(?)ALEN有效,其中T-93的突变效率最高。37℃细胞培养条件下,T-93的突变效率是6%-7%；如果采取30℃低温培养,T-93的突变效率提高到15%～17%。T-93、T-931和T-934的靶点基本一致,区别在于T-931和T-934的识别序列更长,但是,T-931和T-934的突变效率明显低于T-93。将T-93和ssDNA同源模板一起核转染中国实验用小型猪胎儿成纤维细胞后,细胞活力很差,大量死亡,因此还需要继续优化条件。为了建立小型猪1KD2基因敲除模型,本研究利用CRISPR-Cas9技术筛选了针对猪PKD2基因不同外显子的11个靶点：6个靶点有效,其中pX330-1效率最高,达到了11%,其突变位点在第1号外显子,预期能有效造成polycystin-2蛋白失活。已有研究表明CDH16基因在人、小鼠和兔上是一种肾脏特异表达基因。为了在小型猪上实现肾脏特异性基因敲除,需要使用肾脏特异的启动子。因此,本研究对猪CDH16基因进行了鉴定：猪CDH16基因包含18个外显子；在中国实验用小型猪上,CDH16基因在肾脏的转录水平最高,同时在肺中也检测到了少量的转录本；双荧光素酶实验证明猪CDH16基因启动子在LLC-PK1细胞上有启动子活性。综上所述,Ksp-c-Myc-b转基因小型猪未能表现出常染色体显性多囊肾病的病理症状。成功筛选得到的TALEN和CR1SPR-Cas9靶点为构建PKD2基因错义突变或者PKD2基因敲除小型猪打下了基础。猪CDH16基因启动子能够用于构建CRISPR-Cas9的肾脏表达载体,实现小型猪PKD2基因肾脏特异敲除。