研究目的1.研究NKD1在肝癌中的表达情况及其临床病理意义。2.研究NKD1对肝癌细胞侵袭转移能力的影响及其调控机制。3.研究NKD1对肝癌细胞增殖的影响及分子机制。研究方法1.收集临床肝癌组织样本,提取组织中的蛋白质,通过免疫印迹的方法检测NKD1蛋白在配对新鲜组织中的表达情况并统计分析其表达差异;2.收集临床肝癌实验样本,采用免疫组织化学染色的方法,检测NKD1蛋白在肝癌组织中的表达定位和定量情况。根据免疫组化评估得分结果,采用卡方分析的统计学方法,探讨NKD1的临床病理意义;3.体外采用Transwell小室法研究“过表达”和“敲低”NKD1的蛋白表达后,肝癌细胞侵袭能力的改变情况。体内通过建立裸鼠皮下移植瘤肺转移模型研究NKD1对肝癌细胞侵袭转移的影响;4.在过表达NKD1的同时过表达Rac1,通过功能恢复实验和Transwell实验证实Rac1在NKD1调控肝癌细胞侵袭转移能力中的关键性作用;采用免疫激光共聚焦的实验方法,检测NKD1对肝癌细胞骨架重排的影响调控;5.采用免疫共沉淀和免疫荧光的方法检测NKD1和Rac1蛋白的结合情况,通过范素化实验探究NKD1促进Rac1降解的分子途径;6.Real-time PCR实验证实Rac1可促进NKD1的转录水平,通过荧光素酶报告系统检测和细胞共转染的方法证实Rac1对NKD1的转录激活是依赖于EZH2的;7.K-M生存统计分析Rac1和NKD1异常表达对肝癌患者不良预后的影响;8.采用CCK-8、Ed U实验和克隆形成实验,分析NKD1对肝癌细胞增殖能力的影响,体外通过皮下移植瘤模型实验进行验证;9.在NKD1过表达的同时,加入P53特异性的抑制剂,对比观察细胞增殖指标PCNA的改变情况,证实NKD1对肝癌细胞增殖调控部分是依赖于P53的;Real-time PCR实验检测NKD1m RNA在肝癌中的表达水平,统计分析其表达量与肝癌患者的肿瘤大小和生存时间之间的临床相关性。研究结果1.通过免疫印迹实验检测发现,NKD1蛋白在肝癌中的表达量要明显低于癌旁正常的肝组织(P<0.01);2.通过对58例肝癌石蜡样本进行NKD1免疫组化染色实验发现,NKD1在32例样本中是处于低表达,并且其低表达与肝癌患者的不良分化(P=0.003)、肝内外转移(P=0.01)和肿瘤大小(P=0.011)密切相关;3.基质胶侵袭转移实验发现,过表达NKD1可以明显抑制肝癌细胞SMMC-7721和Huh7的迁移与侵袭,然而干扰NKD1的表达可促进Hep G2的侵袭转移能力。体内实验研究发现,通过皮下注射过表达NKD1-SMMC-7721细胞的裸鼠肺部组织和肝内肿瘤转移灶数量和转移率均明显低于对照组(P<0.05),提示NKD1可以在体内外有效抑制肝癌细胞的侵袭转移能力。4.免疫印迹实验发现NKD1过表达可以下调Rac1的蛋白水平,并且NKD1抑制肝癌细胞侵袭转移的能力是依赖于Rac1的。机制探讨发现NKD1可以通过调控Rac1进而影响肝癌细胞骨架重排。5.免疫荧光和免疫共沉淀发现,NKD1与Rac1在细胞浆中存有结合并缩短Rac1的蛋白半衰期。另外,NKD1还可以促进Rac1的泛素化途径依赖的蛋白降解;6.Rac1可以发过来促进NKD1的基因转录,机制探讨发现,Rac1可以减少EZH2的蛋白表达水平,进而促进了NKD1的转录激活;7.肝癌组织中NKD1的m RNA水平明显低于癌旁正常肝组织,而Rac1的蛋白水平在肝癌中是呈现相对高表达。生存分析发现,Rac1和NKD1同时异常表达的肝癌病人手术后生存时间明显低于其他病人(P=0.029);8.CCK-8、Ed U和克隆形成实验证实了NKD1负向调控肝癌细胞的增殖能力;体外皮下移植瘤模型也证实了这一点;9.NKD1过表达后,肝癌中p53和p21蛋白表达增加,而PCNA的表达量明显减少。当加入p53特异性的抑制剂后,NKD1下调PCNA的作用明显被消弱;10.NKD1m RNA水平与肝癌患者的肿瘤大小(P=0.002)和不良预后(P=0.029)明显相关。研究结论1.NKD1蛋白在肝癌中的表达明显低于癌旁正常肝组织,并且其低表达与肿瘤分化、转移和大小密切相关;2.NKD1负向调控肝癌细胞的侵袭转移能力,并且这一能力是依赖于Rac1的;3.NKD1在胞浆中与Rac1结合,并促进其泛素化依赖的蛋白酶体降解;4.Rac1可以通过抑制EZH2的蛋白表达量进而激活NKD1的转录;5.RAC1和NKD1异常表达的肝癌患者术后生存时间明显缩短;6.NKD1负向调控肝癌细胞的增殖能力,并且部分是依赖于p53的;7.NKD1m RNA水平与肝癌患者肿瘤大小和不良预后相关。