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柿(Diospyros Kaki Thunb)是我国广泛栽培的果树之一,其面积和产量位于世界第一。柿原产中国,资源丰富,在国际上有一定优势。位于西北农林科技大学的国家柿种质资源圃收集有560多份材料或品种,这些材料中除部分日本甜柿通过杂交育成,谱系及亲缘关系比较清楚外,其他种质遗传背景不清。要想从更深层次上发掘和利用这些资源,就必须找到一个强有力的进行种质分析的工具。分子标记中的微卫星(SSR)分子标记具有多态性丰富,重复性好,共显性等优点,是目前最重要的分子标记之一;但SSR标记必须采用特异性的引物才能进行PCR检测。柿属于柿科柿属,关于柿的SSR标记,即SSR标记的特异性引物目前尚无报道,也没有相近物种的SSR标记可供转移使用,因而必须自己开发引物,而构建SSR富集DNA文库是快速开发SSR引物的基础。 本试验研究首次构建了柿SSR富集DNA文库,创建了适合柿基因组DNA的SSR引物开发体系。其方法是:将柿基因组DNA经酶切后转变成AFLP DNA片段,然后用生物素标记的简单重复序列(SSR)作探针与其杂交,杂交复合物固定到包被有链霉亲和素的磁珠上,经过一系列的洗涤过程,含有SSR的AFLP片段被吸附在磁珠表面。这些片段经洗脱下来后,先用对应的AFLP引物扩增,再用pGEM-T Easy Vector体系进行克隆,初步用白色/蓝色克隆表现型进行预选,挑选表现为白色的克隆,构建SSR富集DNA文库。文库的进一步筛选采用Colony PCR技术,避免了使用同位素标记杂交选择。其主要结果是: 1、建立了适合柿基因组DNA提取的改良CTAB法,得到的基因组DNA纯度高、质量好、完整,相对分子量大(Molecular Weight≈21.23kb),通过定量稀释,浓度约为100ng/μl。 2、以柿为材料建立了EcoRI/MseI双内切酶酶切、AFLP预扩增体系, 3、建立了用SSR生物素标记探针与基因组DNA的AFLP片段杂交、用磁珠富集法分离微卫星DNA片段的体系。 4、首次构建了柿SSR富集DNA文库及Colony PCR筛选体系,经测序验证,含SSR的克隆占60%,富集效率较高,说明所构建的SSR富集DNA文库实用、有效。