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原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国第二大恶性致死肿瘤,其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。肝癌的发病十分隐匿,导致发现晚,预后差。提高肝癌患者存活率的重要措施就是“早发现、早诊断、早治疗”,其中早期诊断尤为重要。目前HCC的常规筛查和诊断方法包括体格检查,影像学检查及血清甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)检测。AFP作为FDA认证的HCC血清学诊断及筛查标志物已经沿用多年,但其敏感性及特异性仍有待提高。因此,开发新型HCC早期诊断标志物已成为目前肝癌研究热点之一。本课题组前期研究中,应用基因芯片技术发现生长分化因子-15(growth differentiation factor 15,GDF15)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)等12个基因在大鼠诱发肝癌模型早期阶段异常差异表达。随后验证GDF15在小肝癌患者mRNA、蛋白水平均升高表达。以上结果提示GDF15有望成为肝癌早期诊断潜在标志物。目的:制备抗GDF15单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学功能,为后期开发肝癌早期诊断试剂盒奠定实验基础。方法:1.利用RT-PCR技术克隆人gdf15基因;构建GDF15原核表达载体pGEX-4T-2-gdf15,导入E.coli Top10F’菌株,IPTG诱导表达后行Western blot鉴定;将鉴定阳性克隆转接LB培养基后大量表达,亲和层析法纯化GST-GDF15融合蛋白。2.以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠的脾细胞与同系小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依次进行阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆化,最终获得稳定分泌抗GDF15 mAb杂交瘤细胞株。3.以间接ELISA法检测抗体效价;以mAb亚类检测试剂盒进行抗体亚类鉴定;以Western blot鉴定抗体特异性;免疫共沉淀法、质谱分析法、免疫组化验证获得的抗体是否可以与人天然GDF15蛋白特异性结合。亲和层析法纯化抗GDF15 mAb。结果:1.成功构建了pGEX-4T-2-gdf15表达质粒。2.成功诱导表达纯化了GST-GDF15融合蛋白,浓度为2.1mg/ml;纯度达80%以上。3.以GST-GDF15融合蛋白为免疫原,最终获得1株稳定分泌抗人GDF15 mAb杂交瘤细胞株,命名为9G3;抗体免疫球蛋白亚类为IgG1;免疫共沉淀及质谱分析证实抗GDF15 mAb 9G3能与肝癌患者血清中GDF15蛋白特异性结合。免疫组化显示人肝癌组织中GDF15呈阳性表达,主要定位于细胞浆。纯化后抗体浓度为5mg/ml,纯度达85%以上。结论:1.本研究成功构建了pGEX-4T-2-gdf15表达质粒,表达并纯化了GST-GDF15融合蛋白。2.以GST-GDF15融合蛋白为免疫原,成功制备出了抗人GDF15 mAb,可应用于血清学、免疫组化分析,为肝癌早期诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。