慢生型大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum USDA110）,是一种革兰氏阴性固氮细菌。研究慢生根瘤菌参与共生固氮机理,寻找高效固氮菌株,对于农业生产具有极其重要的经济意义。环鸟苷二磷酸（Cyclic guanosine diphosphate,c-di-GMP）作为胞内第二信使,参与调节细菌运动方式转变、胞外多糖及生物膜形成等多种群体行为过程。含GGDEF结构域的鸟苷环化酶和含EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶分别参与c-di-GMP的合成和降解,共同调控胞内c-di-GMP含量变化。随着基因组测序的飞速发展,细菌中这些潜在蛋白质资源被快速挖掘。但是对于能够进行生物固氮的根瘤菌USDA110而言,c-di-GMP合成和降解机制及c-di-GMP在共生过程中的作用尚未得到鉴定。本研究以慢生型大豆根瘤菌USDA110菌株c-di-GMP相关代谢基因为研究对象,探讨根瘤菌c-di-GMP代谢基因酶活及在与植物共生过程中的作用。研究主要结果如下:1.通过生物信息学方法在B.japonicum USDA110鉴定到42个含有GGDEF、EAL或HD-GYP蛋白编码基因。将USDA110菌株16个c-di-GMP代谢基因构建重组质粒转化铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1及衍生菌株PAO1Δwsp F,通过转化菌株菌落表型初步鉴定相关蛋白酶活。蛋白含有DGC活性,能够产生皱缩表型,含有PDE活性,能够使衍生菌株皱缩表型恢复到野生型菌落表型。基于菌落表型的鉴定结果显示,在含有GGDEF结构域基因中,检测到6个基因具有潜在DGC活性。4个潜在的PDE活性基因中,只有HD-GYP结构域基因bll2340能够使Δwsp F菌落表型由皱缩转变成光滑状态。2.在菌落表型鉴定酶活的基础上,检测16个基因对PAO1及Δwsp F菌株胞外多糖,运动性,生物膜的影响。发现过表达含有GGDEF结构域基因bll4347,bll5123,bll1362,bll7151,blr2401能够提高PAO1胞外多糖及生物膜产量,抑制群游运动。过表达含有HD-GYP结构域基因bll2340,能够使Δwsp F胞外多糖含量有所减少,群游运动不受影响,颤搐运动恢复到野生型水平。3.在USDA110中过表达c-di-GMP合成和降解基因,并与豆科植物华夏三号进行共生实验,使用气相质谱测定根瘤中的乙炔还原酶活性表明,含有过表达GGDEF结构域基因bll4347,bll5123,blr0624,bll2326菌株固氮酶活较高,含有EAL和HD-GYP过表达菌株固氮酶活比较低。推测c-di-GMP参与根瘤形成并影响根瘤菌固氮酶活性。4.通过测定根瘤菌胞外多糖,运动性及豆科植物根际粘附实验,探索c-di-GMP调控根瘤菌与豆科植物共生机理。发现过表达bll4347,bll5123,bll7151,blr0624基因菌株菌落表面有较多黏性物质产生,菌株运动性增强,在根毛边际的黏附能力也增强。过表达bll2326基因的菌株,菌落表面有较多粘性物质产生,菌株运动性和根际粘附能力变化不大。过表达了blr2401,bll7113,bll3041,bll1500,bll6704,bll2340基因菌株菌落表面较为干瘪。bll1362,bll2326,bll3041,blr0402,blr1644,bll2340基因过表达菌株,根毛粘附能力减弱。5.本研究采用过表达慢生根瘤菌USDA110 c-di-GMP相关代谢基因bll5123,blr0624,bll4347,bll7151,得到了4株潜在高运动性、高胞外多糖及根毛粘附能力根瘤菌菌株。本研究选取慢生根瘤菌USDA110 c-di-GMP相关代谢基因作为研究对象,探索通过GGDEF蛋白信号通路影响胞内c-di-GMP水平,构建高共生固氮效应菌株。从GGDEF蛋白信号通路的角度研究胞外多糖的变化,能够深入揭示c-di-GMP影响胞外多糖产量及参与宿主植物结瘤和固氮共生的水平因素,为将来人工提高根瘤菌和植物的共生效率提供理论支持。