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大叶藻(Zostera marina L.)是重要的沉水盐生植物,属于沼生目(Helobieae)、眼子菜科(Potamogetonaceae)、大叶藻属(Zostera),是一种常见的海草。为发掘大叶藻抗逆基因、探索其抗逆机制,本实验采用SMART(Switching mechanismat5’end of RNA transcript method)方法构建了大叶藻在不同盐度下的全长cDNA文库,并对文库中的部分单克隆进行了5’末端测序和生物信息学分析,为进一步开展抗逆相关基因的克隆鉴定工作奠定了基础。
以三种不同盐度处理的大叶藻混合mRNA为模板合成cDNA,构建了叶片组织全长cDNA文库。原始文库滴度为8.675×106pfu／mL,重组率为97.19％,扩增后的文库滴度达到1.03×109pfu／mL；插入片段集中在750-2000bp范围,平均长度大于800bp。
随机挑取4081条单克隆进行5’末端测序,获得了3986条有效EST,被组装成145条contigs和1790条singletons,总计1935条unigene。在GenBank dbEST数据库中的注册号为HS089944-HS091857、JG698933-JG699246。通过对序列表达丰度分析发现,metallothionein和chlorophyll a／b-binding protein基因家族的表达丰度最高,分别占总EST的10.2％和1.9％。生物信息学分析表明,1427条unigene在BlastX比对中得到注释,仍然有37.5％的基因未得到注释,说明本次测序得到了大量的未知功能的新基因；COG分析452个基因被分类到22个亚类中；KEGG表明525个基因被分配到241个代谢途径中,其中包括一条近似完整的C3／C4／ChM代谢途径；574个基因得到了740个GO术语；InterProScan分析产生个982个InterPro家族。该文库的构建和EST序列的分析将为进一步了解大叶藻抗逆基因的功能提供有效的信息。
对文库中表达丰度较高的metallothionein和chlorophyll a／b-binding protein基因家族进行了生物信息学分析。发现了12个编码捕光蛋白的基因序列,命名为Lhca1,Lhca2,Lhca3,Lhca5,Lhca6,Lhcb1.1、Lhcb1.2,Lhcb2,Lhcb3,Lhcb4,Lhcb5、Lhcb6,分属于光系统Ⅰ中的Lhca1、Lhca2、Lhca3、Lhca5、Lhca6以及光系统Ⅱ的Lhcb1、Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5、Lhcb6类基因家族。蛋白功能结构域预测分析,该12个编码蛋白质都含有捕光叶绿素a／b结合蛋白功能域和多个功能位点,通过对5个Lhcb的相似性比较发现Lhcb1.1和Lhcb2之间的相似性较高为75％。系统进化树分析表明大叶藻部分Lhc在分类上表现出与双子叶植物更近的亲缘关系。
发现3个编码金属硫蛋白的基因,将其命名为Mtlp-Zm2.1、Mtlp-Zm2.2和Mtlp-Zm3,前两者属于2型金属硫蛋白,Mtlp-Zm3属于3型金属硫蛋白。对Mtlp-Zm2.1和Mtlp-Zm2.2两个基因进行序列分析发现,Mtlp-Zm2.1编码62个氨基酸残基的多肽,其分子量为6.3KD,等电点为4.65,其中含有8个半胱氨酸残基,占总氨基酸的12.9％；Mtlp-Zm2.2编码82个氨基酸残基的多肽,其分子量为8.2KD,等电点为5.18,其中含有14个半胱氨酸残基,占总氨基酸的17.1％。系统进化树分析表明大叶藻Mtlp-Zm2.2与沉水盐生植物具有较近的亲缘关系,进化地位早于陆生植物与淡水生植物的2型金属硫蛋白的编码基因。