前言后发性白内障（after cataract AC）是白内障术后导致视力下降的主要原因。虽可行二期手术截囊或激光后囊切除术，但由此造成的眼前段与后段的沟通不可避免地会出现一些严重的并发症，所以药物预防后发障成为目前研究的重点。后发性白内障的中心问题依然是白内障术后残留的晶状体上皮细胞增殖移行到后囊膜上从而引起后囊膜的混浊（posterior capsule opacification PCO），已经证实多种生长因子在晶状体上皮细胞增殖过程中发挥着极为重要的作用，而受体酪氨酸蛋白激酶信号传导途径是生长因子作用的中心环节。金雀异黄素作为强效的酪氨酸激酶抑制剂，通过诱导细胞分化、诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡，从而抑制晶状体上皮细胞的增殖。我们以往的研究表明，金雀异黄素可抑制离体培养的家兔晶状体上皮细胞增殖，而其对人晶状体上皮细胞增值的影响及作用机制目前尚无报道。自20世纪80年代以来，以单抗为载体的导向药物研究已取得多方面进展。导向药物治疗是利用有一定特异性的载体，把药物选择性地运送到治疗部位以提高疗效，增强药物作用的特异性，并降低药物的毒副作用。细胞只有附着其周围环境（如细胞外基质）后，才能开始生长、分泌、分化及移行。后囊膜作为晶状体上皮细胞生长繁殖的支架，是晶状体上皮细胞赖以生长的特定内环境，如果能在后囊膜上均匀分布细胞毒性药物，即可使药物在靶细胞增殖部位保持长时间的有效浓度，而且还能降低了药物的毒副作用，抑制晶状体增殖的效果就更明确。后囊膜的主要成分为Ⅳ型胶原及层粘连蛋白，利用抗Ⅳ型胶原抗体为中介物，把抗Ⅳ型胶原抗体与金雀异黄素偶联起来，利用抗Ⅳ型胶原抗体与后囊膜特异结合作用，而使金雀异黄素均匀分布在后囊膜，从而抑制晶状体上皮细胞在后囊膜的增殖。目的制备抗Ⅳ型胶原抗体-金雀异黄素偶联物，检测偶联物抗体活性及药物的活性，评价其对人晶状体上皮细胞的抑制作用。为导向药物治疗在眼内应用提供理论依据。方法本研究分三部分第一部分金雀异黄素抑制体外人晶状体上皮细胞增殖的研究1、细胞培养冻存的人晶状体上皮细胞复苏后，用含10％的胎牛血清100U／ml青霉素、100μg／ml链霉素及1.9g／LHEPES的DMEM培养基，37℃、5％CO₂的培养箱中培养，绘制细胞生长曲线。2、MTT测定不同浓度组金雀异黄素不同时间对人晶状体上皮细胞增殖的抑制作用。3、流式细胞仪检测不同浓度组金雀异黄素在24h、48h、72h对人晶状体上皮细胞周期及凋亡的影响。4、逆转录聚合酶链反应检测不同浓度组金雀异黄素作用人晶状体上皮细胞48h后人晶状体上皮细胞内P21、P53、CyclinD1 mRNA表达情况。5、免疫印迹（Western blot）检测不同浓度组金雀异黄素作用人晶状体上皮细胞48h后人晶状体上皮细胞内P21、P53、CyclinD1蛋白表达情况。第二部分抗Ⅳ型胶原抗体-金雀异黄素偶联物制备提纯及检测1、抗Ⅳ型胶原抗体与金雀异黄素通过活性酯法偶联。2、抗Ⅳ型胶原抗体-金雀异黄素偶联物的提纯及检测。3、免疫组织化学实验检测偶联物中抗体活性。第三部分抗Ⅳ型胶原抗体-金雀异黄素偶联物体外抑制人晶状体上皮细胞增殖的研究1、倒置显微镜细胞形态学的观察，偶联物作用人晶状体上皮细胞，观察48h内细胞形态变化，并拍摄细胞生长情况。2、丫啶橙染色观察细胞凋亡情况。3、MTT法分析偶联物作用人晶状体上皮细胞12、24、48h对人晶状体上皮细胞增殖抑制作用。结果1、绘制了人晶状体上皮细胞生长曲线，传代后3-5天为对数生长期。2、不同浓度的金雀异黄素可抑制LECs增殖，在0-75mg／L范围内呈剂量效应关系，并随时间的延长，抑制效应增强。质量浓度为75 mg／L的金雀异黄素作用12 h对hLEC抑制作用与对照组差异有统计学意义（P=0.03），作用24 h、48 h质量浓度为12.5、25、50、75 mg／L的金雀异黄素对LEC抑制作用与对照组有统计学差异（P＜0.05），72 h组各质量浓度的金雀异黄素对LEC抑制作用与对照组均有统计学差异（P＜0.05）。3、随Gen浓度的增大，G₁-S期细胞明显增多。金雀异黄素作用24 h诱导凋亡不明显：在48 h组，质量浓度为12.5 mg／L处理组出现凋亡峰，当质量浓度达到50.0 mg／L时凋亡明显；处理72 h，6.25 mg／L质量浓度组即可诱导凋亡，25mg／L质量浓度组凋亡达51.83％，50 mg／L质量浓度组凋亡达59.3％。4、RT-PCR检测结果显示，随Gen浓度逐渐增高，晶状体上皮细胞P21mRNA的表达逐渐下调，而CyclinD₁的mRNA表达水平上调，而对照组及不同浓度Gen处理组p53的mRNA均有表达，处理组与对照组间有统计学差异，但各处理组间无统计学差异。5、Western blot法检测结果：随Gen作用浓度增加P21蛋白表达逐渐减少，CyclinD₁蛋白表达水平逐渐增高，P53蛋白表达处理组与对照组之间表达有显著差异（P＜0.05），但各处理组间无显著差异。6、抗Ⅳ型胶原抗体与金雀异黄素通过活性酯法成功偶联，本研究偶联产物中抗Ⅳ型胶原抗体与金雀异黄素克分子比为1：439，偶联物与晶状体囊膜可特异结合。7、丫啶橙染色观察经偶联物作用24h、48h后的细胞均发生凋亡的形态学改变。8、偶联物作用人晶状体上皮细胞12、24、48h对人晶状体上皮细胞增殖均有抑制作用，抑制率分别为28.5％、50.3％和76.9％。结论1、金雀异黄素能够抑制人晶状体上皮细胞的增殖，这种抑制是通过细胞周期阻滞和细胞凋亡共同作用的结果。2、采用活性酯法可成功地将抗Ⅳ型胶原抗体与金雀异黄素偶联，偶联物的免疫活性良好。3、抗Ⅳ型胶原抗体-金雀异黄素偶联物体外具有高效的抑制晶状体上皮细胞增殖的作用。