鲤鱼白细胞介素10基因克隆、鉴定及差异表达分析

来源 :吉林大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:liongliong526
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细胞因子是由多种免疫细胞产生的蛋白分子,作用于其他细胞,在启动和调节免疫过程中起到重要的作用。IL-10首次是作为一种免疫抑制性细胞因子而在小鼠中被发现。IL-10主要由Th2细胞产生,除此之外,其他免疫细胞,如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、调节性T细胞、Th1细胞、Th17细胞都能产生IL-10,而非免疫细胞如肥大细胞、上皮细胞、角化细胞及肿瘤细胞也能产生IL-10。它能限制甚至终止免疫应答,调节T细胞、B细胞、天然杀伤性细胞的分化和增殖,但最近的一些研究发现,IL-10不仅起到免疫抑制作用,当炎症作用局限时,IL-10也可以起到免疫促进作用,消除感染性或非感染性的颗粒。目前已经从多种脊椎动物中克隆得到IL-10,如人、鼠、鸡等,对其在哺乳动物机体中的作用已经有比较丰富的研究,但在鱼类中还比较少。 本研究利用EST测序得到的鲤鱼IL-10部分片段标记地高辛探针,应用核酸杂交法筛选有丝分裂原刺激的外周血白细胞cDNA文库,得到鲤鱼IL-10全长cDNA序列,GenBank注册号JX524550,序列全长1204bp,包含一个540bp的开放阅读框,编码179个氨基酸。对其蛋白序列进行分析,发现与金鱼同源性最高,达88.3%,与其他鱼类的同源性在45.5%~87.4%之间,与禽类的同源性在32.7%-33.2%之间,与哺乳动物同源性在25.6%~29.8%之间。然后根据所获得的cDNA序列在两端非编码区以及外显子序列上设计两对引物,以提取的鲤鱼脾脏基因组DNA为模板进行PCR,将得到的两部分序列拼接起来得到鲤鱼IL-10基因组序列,GenBank注册号JX524551。序列全长2176bp,包含5个外显子,4个内含子,与其他物种IL-10结构相同,内含子剪切位点符合GT-AG规则。第三部分实验中,用不同有丝分裂原刺激鲤鱼外周血白细胞,在培养不同时间后提取RNA,用荧光定量PCR方法分析各组中IL-10表达量的变化,结果表明实验组IL-10表达量均有提高,LPS和PHA共同刺激作用强于ConA,反应更加迅速持续时间更长,表明IL-10在细胞受到刺激后的早期即开始发挥免疫作用。最后一部分实验是用灭活的嗜水气单胞菌对鲤鱼进行皮下注射,在刺激不同时间后提取不同组织部位RNA,半定量PCR分析IL-10在不同部位的表达量情况及随时间的变化情况,发现头肾和脾脏中表现最强,并且在刺激之后其表达量有明显升高,鳃其次,心脏和肝脏中较弱,并通过荧光定量PCR分析头肾和脾脏组织中IL-10随时间的变化情况,结果发现头肾中IL-10升高更加明显,持续时间更长,表明头肾在鲤鱼的早期免疫中发挥重要作用。
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