ATP结合盒转运蛋白G1(ABCG1)是一种跨膜蛋白,通过水解ATP释放的能量驱动底物进行跨膜转运。ABCG1介导胞内脂质外流,参与胆固醇逆转运,维持细胞胆固醇稳态,在动脉粥样硬化的发生和转归中具有重要意义。然而,以往利用基因修饰动物模型有关ABCG1与动脉粥样硬化相关性的研究结果并不一致,因此,ABCG1在动脉粥样硬化中的作用尚不完全清楚。本课题组前期的研究表明,ABCG1启动子区域rs57137919位点基因多态性-367G>A显著降低冠心病发病的危险性[1]。该基因变异同时抑制ABCG1转录和蛋白翻译水平,提示在ABCG1低表达可能具有对抗动脉粥样硬化的作用。基因多态性-367G>A的受试者,其单核细胞来源的巨噬细胞ABCG1蛋白表达显著降低,ABCG1介导的胆固醇外流减少,巨噬细胞凋亡明显加快,促凋亡基因表达显著增高,可能是抵抗早期动脉粥样硬化病程进展的重要机制[2]。本研究将在前期研究基础上,关注ABCG1低表达对巨噬细胞功能(氧化固醇外流与沉积、吞噬、脂质摄取、炎症反应)的影响,及其潜在的分子机制。同时构建ABCG1敲除小鼠和人ABCG1转基因小鼠模型,利用转录组测序技术,观察ABCG1表达改变后,其他动脉粥样硬化相关基因转录水平的变化,为ABCG1功能的研究提供新的思路。一、研究目的1.利用ABCG1低表达的THP-1细胞系,从细胞学层面,探究ABCG1低表达对巨噬细胞功能的影响,以及相关分子机制。2.构建表达人ABCG1的转基因小鼠模型以及ABCG1敲除小鼠模型。3.利用ABCG1敲除小鼠,探究ABCG1缺失对动脉粥样硬化相关基因转录水平的影响。二、研究方法1.对ABCG1低表达的THP-1细胞株进行鉴定。利用LC-MS/MS测定巨噬细胞经ABCG1途径的氧化固醇外流变化和细胞内固醇沉积情况,ELISA测定细胞炎症因子分泌水平,RealtimePCR进行巨噬细胞极性分子检测,荧光显微镜及流式细胞术检测巨噬细胞脂质摄取,流式细胞术检测巨噬细胞吞噬能力。利用SP600125(JNK通路抑制剂),SB203580(p38MAPK通路抑制剂)和GW9662(PPAR-y通路抑制剂)探究ABCG1低表达调控巨噬细胞功能的分子机制。2.构建BAC转基因载体,利用原核注射方式获得转基因小鼠。转基因小鼠与B6背景鼠繁育,通过PCR筛选遗传稳定的后代小鼠进行后续实验。通过基因打靶方式获得ABCG1敲除小鼠,ABCG1敲除小鼠与B6背景鼠繁育,PCR筛选阳性子代。3.通过密度梯度法分离小鼠外周血单个核细胞,提取总RNA,利用PCR扩增构建cDNA文库。利用Illumina二代高通量测序平台,采用PE150测序策略进行测序,对原始reads进行质控,去除低质量和含有测序接头的reads。然后利用Tophat2软件完成比对和转录本拼接分析。利用DESeq软件并进行差异基因分析,利用GO数据库进行GO富集分析,利用KEGG数据库进行KEGG分析。三、研究结果1.ABCG1低表达对巨噬细胞功能的影响及机制探究(1)LC-MS/MS技术检测巨噬细胞氧化固醇外流及胞内沉积。与无外流接受体的空白对照组相比,HDL作为外流接受体后,其7-KC和7β-OHC外流率显著增加(7-KC,28.6%±2.3%vs.4.1%±0.7%,p<0.001;7β-OHC,35.5%±5.7%vs.3.7%±1.1%,p<0.001)。与ABCG1正常表达的巨噬细胞(对照组)相比,ABCG1低表达的巨噬细胞,其 7-KC 和 7β-OHC 的外流率显著降低(7-KC,16.1%±3.1%vs.24.7%±2.3%,p=0017;7β-OHC,15.7%±0.7%vs.33.1%±3.7%,p<0.001)。以上结果显示,巨噬细胞ABCG1低表达能够降低7-KC和7β-OHC外流率。我们进一步检测了巨噬细胞内氧化固醇的沉积。胞内氧化固醇沉积量通过细胞总蛋白进行校正。ABCG1低表达的巨噬细胞其胞内氧化固醇沉积较对照组显著增加(μg/mg细胞总蛋白;7-KC,6.61±1.28vs.2.13±0.08,p=0.026;7β-OHC,1.61±0.51vs.0.65±0.20,p=0.039)。(2)负载50μg/mlox-LDL后,ABCG1低表达的巨噬细胞,其CD86表达水平高于对照组(p=0.002),而 CD163(p=0.021)与 TGF-β(p=0.01)水平低于对照组。ELISA 结果显示,ABCG1低表达能够导致IL-6分泌水平增加(pg/ml,3.67±0.48 vs.10.76±1.12,p=0.002),TGF-β 分泌水平降低(pg/ml,522.33±58.5vs.238.94±26.06,p<0.001),提示ABCG1低表达时巨噬细胞炎症反应加剧。(3)与对照组相比,ABCG1低表达的巨噬细胞,其胞内红色荧光增强。流式结果显示,ABCG1低表达的巨噬细胞其胞内平均荧光强度高于对照组(131150.00±27766.75vs.91361.50 ± 5961.99,p<0.05)。以上结果提示,ABCG1 低表达能够促进巨噬细胞对ox-LDL的摄取。(4)将巨噬细胞与紫外诱导的凋亡细胞共孵育后观察巨噬细胞吞噬能力,与对照组相比,ABCG1低表达的巨噬细胞吞噬能力显著增强(35.6%±2.9%vs.11.0%±1.3%,p<0.001)。Mertk 和 CD36 是凋亡细胞的吞噬受体。RealtimePCR 和 Wetsern blot 显示ABCG1敲低后CD36和Mertk表达均出现上调(CD36 mRNA表达,与对照组相比,p=0.006;CD36蛋白表达水平,与对照组相比,p=0.009;MertkmRNA表达,与对照组相比,p=0.003;Mertk蛋白表达水平,与对照组相比,p=0.004)。PPAR-γ是CD36与Mertk上游调控分子。与对照组相比,ABCG1低表达能够增加PPAR-γmRNA(p<0.001)和蛋白表达水平(p = 0.007)。(5)PPAR-γ抑制剂GW9662能够逆转ABCG1敲低后CD36和Mertk的表达上调。ABCG1低表达的巨噬细胞,其p-JNK水平增加。JNK抑制剂SP600125能够逆转ABCG1低表达造成的凋亡及吞噬相关分子(Bcl-2,Bim,CD36,Mertk,PPAR-γ)的表达改变。P38 MAPK抑制剂SB203580不能够逆转ABCG1低表达造成的凋亡及吞噬相关分子的表达改变。上述结果提示,JNK通路和PPAR-γ通路参与了 ABCG1低表达对巨噬细胞功能的调控,没有发现p38 MAPK参与上述功能的改变。2.基因修饰小鼠的构建(1)经原核注射得到51只子代小鼠,PCR鉴定得到8只阳性首建鼠(founder)。挑选雄性小鼠与B6背景鼠配繁建系,利用PCR鉴定子代小鼠基因型,共得到17只遗传稳定的转基因小鼠(B line)。(2)3只雄性ABCG1敲除小鼠(纯合子)与B6背景鼠配繁得到F1代杂合小鼠,F1代兄妹配繁得到ABCG1敲除纯合子代。经PCR鉴定,共得到17只纯合ABCG1敲除小鼠,同时获得28只同窝野生型对照。3.转录组测序(1)各标本干净数据均大于3G,单个碱基位置的测序错误率均低于1%。Q20与Q30均大于90%,未出现AT、GC分离现象。各标本reads比对率均大于70%,比对到多个位置的reads比例基本不超过10%。数据质量良好。(2)与野生型对照相比,ABCG1敲除组有605个差异表达(q值<0.005)的基因,包括306个表达上调的基因和299个表达下调的基因。在这些差异表达的基因中,54个基因参与了代谢的调控,其中13个基因与脂代谢有关。21个基因与细胞吞噬作用相关。此外,还有8个基因参与细胞粘附,6个基因参与白细胞迁徙,6个基因参与细胞因子-细胞因子受体相互作用。(3)转录组分析发现7个显著富集的GOterm,其中3个term涉及分子功能,4个term涉及生物过程。分子功能类别中包含了 GTP结合,鸟苷酸核苷酸结合和鸟苷酸核糖核苷酸结合。生物过程类别包含了免疫系统过程,免疫反应,小GTP酶介导的信号转导和细胞内信号转导。(4)本研究发现19个显著富集的通路。这些通路中包括1型糖尿病,自身免疫甲状腺疾病、先天性免疫缺陷等免疫疾病,抗原加工与提呈,以及病毒感染、脂肪酸生物合成和代谢,MAPK信号通路等。四、研究结论1.ABCG1低表达抑制细胞内氧化固醇外流,从而使其在细胞内沉积,促使细胞炎症反应和脂质摄取,并增强细胞吞噬功能,上述改变可能发挥抗动脉粥样硬化作用。JNK通路和PPAR-y可能参与了以上功能的改变。2.ABCG1敲除小鼠,其与动脉粥样硬化相关的多个基因出现转录水平的改变(脂代谢、细胞凋亡与吞噬、细胞趋化和细胞粘附),这些发现可能为今后利用该模型进行动脉粥样硬化相关表型和分子机制研究提供新的方向。