由于近年来世界范围内对大米数量和质量的要求不断提高,而传统的储藏方式不但成本高且损失高,使得全球大米市场面临潜在的威胁。因此,有关水稻耐储藏性能的研究出现了前所未有的高潮。稻谷储藏过程中的陈化变质以及陈臭味的产生等问题,是引起大米质量下降的主要原因,而脂肪氧化酶则是催化脂类过氧化反应并产生挥发性物质的关健酶,它是一种含有非血红素铁的双加氧酶。水稻成熟种胚中主要存在3种脂肪氧化酶的同工酶,即LOX-1、LOX-2和LOX-3,其中,LOX-3含量最多,活性最强。本研究通过对LOX-3基因反义表达的水稻转基因株系的分析和鉴定,探讨LOX-3与水稻种子耐储藏性能的关系,主要结果如下:1.利用农杆菌介导籼稻的遗传转化,将构建好的3个含有LOX-3基因的反义植物表达载体pHG1PL,pHG4PL和pHG4P500L分别导入籼型恢复系“航1号”和“航2号”中,获得相应的转基因植株后,经PCR和Southern blot分析,结果表明反义LOX-3基因已经整合到水稻基因组中;对比转基因水稻和亲本对照种胚LOX-3的表达情况,发现转基因水稻种胚LOX-3的表达量与亲本对照相比明显降低且差异极显著,这表明反义LOX-3基因的导入成功抑制了转基因植株胚乳中LOX-3基因的表达。2.考查了转基因植株与亲本对照的田间表型,发现在所有调查的转基因株系中,除了编号63与其相应的亲本“航1号”在分蘖数和结实率方面差异显著外,其他株系与亲本在株高、分蘖数、结实率和千粒重方面均无显著差异,这表明抑制水稻胚乳中LOX-3基因的表达对其他农艺性状没有造成显著影响。3.利用KI-I2-淀粉显色法检测转基因水稻种胚脂肪氧化酶LOX-3活性,对比显色结果发现,亲本对照呈暗红色,LOX-3缺失材料DawDam呈无色,而转基因材料则呈浅红色,初步表明,转基因材料种胚LOX-3活性与亲本相比有所降低;同时,采用高效液相色谱法对转基因水稻和对照种胚中的亚油酸含量进行检测,发现转基因水稻种胚亚油酸含量高于对照,且差异显著,结果进一步证实反义LOX-3基因的导入已成功降低转基因水稻种胚脂肪氧化酶活性。4.为了进一步探明LOX-3在稻谷储藏过程中所发挥的作用,本研究分别利用人工老化和自然老化方法,对比转反义LOX-3基因水稻种子与对照的耐储藏性能,结果发现,经人工老化和自然老化处理后,转基因水稻种子与对照种子的发芽率均有所下降,而且随着老化时间的延长,下降的幅度逐渐增大。同时,不论是经人工老化处理后的转基因水稻种子,还是经自然老化处理的转基因水稻种子,它们的发芽率都明显高于同期且同种处理的对照种子的发芽率。结果表明,通过降低水稻胚乳LOX-3活性可以实现提高种子储藏性能的目的。5.利用扫描电镜观察转基因水稻种子与对照种子人工老化前后淀粉粒形状,发现老化前转基因种子中淀粉粒形状规则,大小一致且排列紧密,而对照种子中淀粉粒的形状和大小则不是很均一,排列也比较松散;人工老化30d后,转基因种子中部分淀粉粒的结构发生了变化,形状和大小都没有处理前均一;与转基因种子相比,对照种子中淀粉粒结构变化更加显著,形状和大小更加不规则,排列也更加松散。这表明通过导入反义LOX-3基因抑制水稻胚乳中脂肪氧化酶LOX-3的表达,有效减弱了淀粉的降解,提高了转基因水稻的耐储藏性。6.分析转基因株系与对照米质比较的结果,发现转基因材料中脂肪含量均高于对照,人工老化后,虽然它们的脂肪含量均有所下降,但是前者的降幅较低。结果表明,反义抑制水稻胚乳中LOX-3的表达并没有造成稻米品质的显著变化;而转基因材料中脂肪含量的提高说明通过降低水稻胚乳中LOX-3的活性可以在一定程度上减弱脂类的分解作用。7.利用iTRAQ标记结合液相色谱串联质谱技术构建反义LOX-3转基因水稻、对照以及耐储藏水稻品种云恢290和福恢7185在人工老化处理前后的差异蛋白质表达谱,通过GO注释、COG注释和KEGG代谢通路注释分析差异蛋白所行使的功能以及所参与的代谢通路,为揭示LOX-3在稻米储藏方面所发挥的作用提供理论依据,从而为进一步探索水稻耐储藏分子机制提供参考。8.通过对比两种不同的热激方法对转基因株系中选择标记基因Bar的删除效率,发现以生长到四叶期的转基因水稻植株为热激材料删除效率较高,达到83.3%,从而确定适合水稻标记基因删除的方法,最终获得无选择标记的转基因水稻,提高转基因水稻的生物安全与食用安全。