目的：通过建立beagle犬股骨髁的富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin, PRF)骨诱导模型,对比观察PRF、Bio-Oss、自体骨松质三种不同骨替代材料的成骨效果,探讨PRF诱导骨再生过程中新生骨的微观结构和生物力学性能,综合评价PRF修复骨缺损的特点和优势,为PRF在诱导骨再生及颌骨重建的临床应用提供新的实验依据。方法：1.动物模型的建立成年雄性beagle犬13只,随机选择其中12只,每只经腹腔麻醉后,采静脉血9 m1×3支试管,离心10 min,速度为3000 r/m,取出试管中层的PRF,工具盒压制成膜备用；选择双侧后下肢股骨内侧髁,制备直径6.0 mm、深度10 mm的三个圆柱形骨缺损,根据各犬解剖结构的条件尽可能分散排布,间隔大于3mm,标记定位钉。用PRF膜、Bio-Oss骨替代材料及自体骨骨松质随机填入3处骨缺损,相应大小的海奥生物膜覆盖于Bio-Oss和自体骨充填的骨缺损表面,分层对位缝合关闭创口。余下的一只实验犬,按相同方法切开、显露术区后,仅制备一处缺损,未填任何骨替代材料,作为空白对照。术后常规护理,根据所填材料不同,分为PRF组、Bio-Oss组和自体骨组,分别简称为P组、B组、Z组；根据取材时间的不同,将12只相同处理的beagle犬随机分为2组为A组和B组,每组6只,编为A1～A6和B1-B6号；空白对照的一只犬为C组。犬A组和C组术后观察3个月、B组观察6个月后取材(表1-1)。2.大体观察和X线检查首先,A组、B组实验犬术后当天、术后1个月行X线检查。然后,按照实验设计,在要求的时间节点上,经麻醉后空气栓塞处死动物,取双侧股骨髁,进行大体观察和拍摄X片。再将其用生理盐水纱布包裹放入容器。X线检查均采用相同的投照角度、距离、曝光时间。完毕后,将左侧标本储存于-20℃冰箱中,右侧浸泡于生理盐水中,分别记为L和R,备用。3. Micro-CT测量分析首先,打磨A、B组犬的右侧股骨髁的外侧面,使其平行于内侧面,将标本水平固定于样本杯中,Micro-CT至上往下轴向扫描。扫描高度为15mm,跨越790层,积分时间250ms,管电压为70kVp,电流为114μ A,层距为19μ m,图像矩阵2048像素×2048像素。采用软件μCT V6.1对图像进行重建分析,在新生骨区选取直径3mm和高度1.5mm的柱形区域,重复三次,三维高斯滤波(sigma 1.2, support 1)对图像进行降噪处理。然后,控制阈值范围,PRF和自体骨松质充填区域阈值为220～1000,Bio-Oss区域中新生骨阈值为220-340,Bio-Oss颗粒阈值为341-1000。得到标本的以下参数：骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目、骨小梁间距、各向异性程度和连接密度,由于移植材料不同,将分区域进行Micro-CT的数据分析,因此分为P组、B组和Z组,之后进行统计学分析。4.植入扭矩的测定打磨A、B组实验犬的右侧股骨髁无新生骨一侧即外侧,至10mm高度。将标本术区向上于台虎钳上固定,剥离多余的软组织,确定三处骨缺损的中心,逐级备洞,棘轮扳手植入DIO种植体Φ3.8*10mm,以植体顶端平齐骨平面为准,数显扭矩扳手测量扭矩。整个过程均注意间歇预备和冲洗降温,分别记录P组、B组和Z组的手动棘轮扳手和数显扭矩扳手的扭矩值,进行统计学分析。5.骨压缩实验由于实验设计和条件的限制,无法在取材后立即行骨压缩实验,按生物力学实验对标本的保存要求,我们已将前期取材的A、B组实验犬的左侧股骨髁用生理盐水纱布包裹,冷冻于-20℃冰箱里。实验前将其置于室温下,自然复温。固定标本,在Bio-Oss和自体骨处理后形成的新生骨区域使用环形取骨钻取出高度为10mm,直径为5.5mm的圆柱形骨块。按设计要求,用高速手机磨去多余骨组织,使两端平行,得到经游标卡尺测量高度约为9mm的骨标本,该过程注意间歇钻取和冲洗降温,分别记为P组、B组和Z组备用。采用万能力学试验机,仪器归零后,在恒定室温下,游标卡尺测量两模具间距即是准确的骨高度并输入系统,以1 mm/min的加载速率轴向加压,保持实验骨湿润,直至骨出现压缩骨折,获得新生骨的力学数据,绘制载荷一位移、应力一应变图,计算得到每个标本的刚度、强度、弹性模量,进行统计学分析。结果：1.13只实验动物手术顺利完成,愈合良好,成功建立beagle犬股骨髁的PRF骨诱导模型。2.大体观察P组、B组和Z组术后3个月时：术区软组织解剖层次不清,瘢痕明显,关节囊内有少许积液,见部分未降解的生物膜被结缔组织包裹,固定于原处。骨膜愈合良好,剥离骨膜,三组均见骨表面轻微凹陷,边界欠清,未见Bio-Oss残留颗粒。P组、B组和Z组术后6个月时：术区仍有瘢痕存在,关节囊内积液有所减少,未见明显的生物膜残留。三组仍有骨凹陷存在,较3个月时凹陷变浅,边界欠清。空白对照组术后3个月时：软组织愈合无明显异常,但骨缺损处凹陷明显。3.X线检查P组、B组和Z组术后当天的X线影像显示：与周围正常骨组织相比,P组密度显著降低；Z组密度略微降低；B组呈高密度影像；三者与周围骨组织的界面清晰。P组、B组和Z组术后1个月的X线影像显示：较术后当天影像,P组密度逐渐增高,低于周围骨组织；Z组密度增高,接近周围正常骨组织；B组密度降低,但仍略高于周围骨组织,范围未见明显缩小；三者与周围骨组织之间的界面模糊。P组、B组和Z组术后3个月的X线影像显示：较术后1个月,P组密度进一步增高,仍略微低于周围骨组织,界面不清；Z组密度增高,近似周围骨,与周围骨组织无明显界面；B组密度明显降低,但依然高于周围骨组织,高密度影像团块范围向中心缩小,与周围骨组织之间的界面可见一圈低密度影。P组、B组和Z组术后6个月的X线影像显示：较术后3个月,P组和Z组密度均接近周围正常骨组织,无明显界面；B组高密度影像团块范围进一步向中心缩小,形状不规则,其界面仍可见一圈缩窄的低密度影环绕,移行呈融合影。空白对照组术后3个月的X线影像显示：骨缺损见区明显的圆形低密度影,由四周向中央密度锐减,界面较清。4. Micro-CT测量分析断层扫描图像：3个月时,P组与Z组相似,均较周围正常骨组织密度稍低,清晰可见较规律排列的骨小梁,无明显界面：然而,B组呈高密度影,界面较清。6个月时,三者界面均不清,P组和Z组骨小梁的量逐渐接近周围骨组织,B组高密度影像范围缩小。空白对照组3个月时,骨缺损区呈低密度影像,骨小梁极少,与周围正常骨组织有质的区别,界面清晰。三维重建图像：天然骨区域骨小梁连续,结构清晰,排列有序,呈条或板状。3个月时,P组新生骨骨小梁呈宽大的板状,厚度较厚,但数量较少,连续性良好；Z组新生骨骨小梁的宽度、厚度、数量、密集程度均介于P组、B组之间,连续性良好；B组新生骨紧紧包绕Bio-Oss颗粒表面生长,骨小梁呈条索状,梁细、量多、紧密；空白对照组修复性骨再生失败,无连续性骨小梁,骨痂呈点状分布。6个月时,P组和Z组较3个月时,骨小梁数目、厚度稍有增多,排列更紧密；B组骨小梁反而略有变细,排列逐渐变稀疏,向正常骨组织形态衍变。B组的双色界面图,从3个月到6个月,红色部分的Bio-Oss颗粒范围向中心缩小,所占据的体积明显减小,逐渐被新生骨取代,界面呈向心性移动,成骨表现为向心性方式。P组界面图,由于新骨与周围骨没有明显的阈值区别,界面不明显,但仍然可以看到随时间的变化,骨小梁从中间向周围逐渐致密,同时中央空洞区域缩小和稀疏程度逐渐降低,密度逐渐增加。全部指标骨体积分数(bone volume fraction, BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb. Th)、骨小梁数目(trabecular number, Tb.N)、骨小梁间距(trabecular spacing, Tb. Sp)、各向异性程度(degree of anisotropy, DA)和连接密度(connectivity density, Conn. D)组间差异均有显著性；两两比较得出全部指标均为P组、Z组与B组的差异具有显著性意义(P<0.05),P组和Z组差异无显著性意义(P>0.05)；组内两个时间节点的差异无统计学意义(P>0.05)。骨体积分数、骨小梁数目、骨小梁间距、连接密度反映出：P组和Z组的新生骨体积、数量、骨小梁分离度、连接密度均接近天然骨,但不如天然骨；相比天然骨,其主要差别表现为新生骨体积稍小,数量较少,空间排布略疏,连接密度较低。而B组的值远远高于天然骨,表现为新生骨体积大、数量多,空间排布紧密,连接密度高。骨小梁厚度、各向异性程度反映出：P组和Z组新生骨的骨小梁厚度及各向异性程度接近天然骨,骨成熟度良好；B组不如天然骨,新生骨的骨小梁非常细,各向异性程度也较低,骨成熟度差。随时间的延长,三组新生骨的各项指标有向天然骨衍变的趋势。5.植入扭矩的测定36颗种植体均按要求成功植入P组、B组和Z组。三组的数显扭矩扳手和手动棘轮扳手所测得的植入扭矩值,方差分析示组间差异均有显著性意义。两两比较发现,3个月时,P组、Z组与B组的差异有显著性意义(P<0.05),P组与Z组的差异无显著性意义(P>0.05)；6个月时,P组、B组与Z组的差异有显著性意义(P<0.05),P组与B组的差异无显著性意义(P>0.05)。组内两个时间节点的差异无统计学意义(P>0.05)。各组的特点和随时间变化的情况：3个月时,P组和Z组的扭矩值接近,两者小于B组；6个月时,P组的扭矩值小于Z组,与B组接近。P组和Z组扭矩值都随时间的延长而增大,但B组则相反。6.压缩实验完整取出P组、B组和Z组的圆柱形新生骨标本,共36块,成功完成压缩试验。三组标本的刚度、弹性模量和强度组间差异均无显著性意义(P>0.05),组内两个时间节点的差异无显著性意义(P>0.05)。但其均数显示,3个月时P组较接近B组和Z组,6个月时P组和B组均不如Z组,并且随愈合时间的延长而增大。PRF新生诱导骨的生物力学性能,3个月时与Z组的新生骨相当,6个月时虽不及Z组但与B组的新生骨相近。结论：1.本实验通过制备犬股骨髁的临界性骨缺损,成功建立beagle犬股骨髁的PRF骨诱导模型。2.实验制备的骨缺损,自身无法完成修复性骨再生,符合临界性骨缺损的标准。3.PRF在修复骨缺损的过程中,X线影像和Micro-CT图像均表现为向心性成骨方式。4.PRF可诱导新生骨形成,其新生骨的微观结构与自体骨松质组的新生骨相当,相比Bio-Oss组的新生引导骨,它更接近生理状态。3个月和6个月这两个时间节点上,PRF新生诱导骨的质量的差异无显著性意义,但各项指标的均数随着时间的延长向天然骨组靠近。5.PRF组新生骨的植入扭矩随时间的延长而增大,反映骨的质量增高,与自体骨组相似,Bio-Oss组相反；6个月时,三组的新生骨均能为种植手术提供植入所需的扭矩条件,但缩短等待骨缺损修复的时间尚需慎重。6.PRF诱导、Bio-Oss及自体骨引导形成的新生骨抗压能力有随时间延长而增大的趋势,但差异无显著性意义,因此尚不能认为6个月比3个月的新生骨的力学性能有所增高。7.3个月时PRF、Bio-Oss、自体骨的新生骨的刚度、强度、弹性模量较接近,6个月时PRF组和Bio-Oss组均不如自体骨组,但组间差异均无显著性意义,尚不能认为哪种骨替代材料的新生骨生物力学性能更高,因此,可能需要延长观察时间。