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碱性螺旋环螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子在真核生物生长、发育和细胞分化中发挥着重要的调控作用。bHLH转录因子含有一个bHLH结构域,这个结构域由一个DNA结合碱性区(DNA-binding basic region)和由一个环区(loop)连接的两个α螺旋(α-helices)结构域构成。分化抑制因子(inhibitor of differentiation,ID)属于bHLH蛋白家族,只有HLH结构域,没有basic结构域。ID分子都可以与bHLH蛋白作用,抑制bHLH与DNA的结合,故又称为DNA结合抑制因子。ET2融合蛋白融合了E蛋白的激活结构域(activation domain,AD)和干细胞白血病蛋白(stem-cell leukemia,SCL)的bHLH结构域。ET2融合蛋白可以作为ID1的的竞争性抑制剂。本学位论文通过GenBank获得斑马鱼tcf3a、tcf3b、tcf12和scla基因序列,通过设计引物来扩增tcf3a、tcf3b、tcf12和scla基因ORF,经酶切连接到pcDNA3.1(+)-c-myc载体,经测序确定pcDNA3.1(+)-tcf3a-c-myc、pcDNA3.1(+)-tcf3b-c-myc、pcDN3.1(+)-tcf12-c-myc、pcDNA3.1(+)-scla-c-myc质粒构建成功。将测序得到的tcf3a、tcf3b、tcf12和scla基因序列翻译为蛋白质序列,并预测其结构域,从而设计接头引物,扩增tcf3a-scla、tcf3b-scla、tcf12-scla、e2-2-scla、e2-2b-scla融合基因,经酶切连接至pcDNA3.1(+)-c-HA载体,经测序确定pcDNA3.1(+)-tcf3a-scla-c-HA融合蛋白质粒、pcDNA3.1(+)-tcf3b-scla-c-HA融合蛋白质粒、pcDNA3.1(+)-e2-2a-scla-c-HA融合蛋白质粒、pcDNA3.1(+)-e2-2b-scla-c-HA融合蛋白质粒、pcDNA3.1(+)-tcf3a-scla-c-HA融合蛋白质粒构建成功。将构建好的所有质粒用于体外转染鲤鱼上皮瘤细胞系(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC)来分析五种融合蛋白对ID1的抑制作用。实验结果表明,五种融合蛋白对ID1都没有呈现显著性的抑制作用。为了研究这五种融合蛋白在体内对ID1的抑制作用,我们通过构建Tol2转基因质粒,利用热休克蛋白70启动子(hsp70 promoter),热激后表达融合蛋白及荧光蛋白(TagRFP),并利用斑马鱼胚胎注射技术构建相应的融合蛋白转基因斑马鱼F0代。结果表明:Tol2-hsp70pro-P2A-TagRFP,Tol2-hsp70pro-TCF3a-SCLa-P2A-TagRFP,Tol2-hsp70pro-TCF3b-SCLa-P2A-TagRFP,Tol2-hsp70pro-TCF12-SCLa-P2A-TagRFP,Tol2-hsp70pro-E2-2a-SCLa-P2A-TagRFP,Tol2-hsp70pro-E2-2b-SCLa-P2A-TagRFP质粒都构建成功,而相对应的转基因斑马鱼F0代尚没有构建成功。今后我们还需要重新进行转基因斑马鱼构建并进一步筛选出能稳定遗传的转基因斑马鱼。