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研究背景前列腺癌（prostate cancer,PCa）是男性常见的生殖系统恶性肿瘤,其发病率在西方国家男性恶性肿瘤中位居第二位,随着疾病筛查技术的成熟及普及,近年来PCa的发病率在我国男性人群中亦呈上升趋势。PCa属于激素调控性恶性肿瘤,雄激素是其发生发展的主要动因。通过与雄激素受体（androgen receptor,AR）结合,激活大量的下游靶基因,以此滋养肿瘤细胞的生长。所以,PCa患者即使由于肿瘤突破前列腺包膜发生远处转移,抑或高龄、合并其他严重疾病等原因而失去手术指征,依然可以通过去势治疗（androgen deprivation therapy,ADT）获得很好的疗效。然而,大多数患者在经过一段时间的应答期后,都会产生激素抵抗,进展为去势抵抗型前列腺癌（castration resistant prostate cancer,CRPC）。尽管二线抗雄激素药物（阿比特龙脂以及恩杂鲁胺）在临床上得到广泛应用,但其疗效有限,仅能够延长数月的生存期。因此,研究激素非依赖型前列腺癌（androgen-independent prostate cancer,AIPC,ADT后复发的所有类型PCa）的发生机制以及寻找新的治疗靶点,对临床诊疗有着极为重要的价值。AR作为转录因子,在PCa的进展过程中扮演重要角色。传统的ADT治疗以及其他的抗雄药物均是作用于AR信号通路（抑制雄激素合成或阻断雄激素与AR结合）发挥药理功效。然而在众多的PCa病理类型中存在着不表达甚至不依赖于AR的特殊类型,如神经内分泌型前列腺癌（neuroendocrine prostate cancer,NEPC）,其恶性程度高,预后差,对抗雄治疗几乎无应答。由此可见,单纯的AR相关性治疗并非完美无缺,新的治疗靶点的探寻迫在眉睫。肿瘤细胞与正常细胞在能量代谢方面具有显著差别。谷氨酰胺作为人体最为丰富的氨基酸,是多种恶性肿瘤的能量营养来源。大量研究及临床经验表明,PCa对葡萄糖的摄取量远低于谷氨酰胺,因此,本课题拟研究谷氨酰胺代谢在PCa中的作用及其对PCa进展的影响,并籍此探索独立于AR信号通路之外的治疗靶点。研究目的本课题拟从能量代谢的角度探讨谷氨酰胺在不同阶段的PCa中代谢表型的改变以及其限速酶谷氨酰胺酶1的表达变化,综合分析其对PCa产生激素抵抗并进展为AIPC所产生的影响,以期阐明AIPC发生的新机制并寻找潜在的治疗靶点。研究方法1.液相质谱分析方法（LC-MS）测定细胞内及培养液中的代谢产物的含量。2.13C5-谷氨酰胺同位素示踪剂追踪谷氨酰胺在代谢过程中的流向,并结合LC-MS方法检测谷氨酰胺代谢通路中各级代谢产物的水平。3.台盼蓝染色及MTS方法检测细胞活力。4.Western blot方法检测ASCT2,GLS1,KGA,GAC等蛋白的表达水平。5.qRT-PCR方法检测ASCT2,GLS1,KGA,GAC等目的基因的mRNA含量。6.免疫组织化学染色方法检测人体或动物组织标本中GLS1,KGA,GAC等蛋白的表达水平。7.siRNA细胞瞬时转染方法用于短暂性敲低GLS1的蛋白表达。8.细胞病毒感染方法用于建立KGA,GAC低表达以及GAC过表达的稳定细胞系。9.Transwell细胞侵袭实验用于检测细胞在不同条件处理后的侵袭能力的改变。10.动物实验用于检验GAC过表达后肿瘤对ADT的抵抗作用、GLS1选择性抑制剂CB-839对肿瘤生长的抑制效应以及建立CRPC动物模型用于检测KGA和GAC两种剪接体蛋白表达水平的转换现象。11.染色质免疫共沉淀方法（ChIP）用于检验AR与GLS1基因的结合关系。12.基因重组实验用于构建pRL-CMV-GLS1-3’UTR,pRL-CMV-GLS1-3’UTR-mutAREI,pRL-CMV-GLS1-3’UTR-mutAREII以及pRL-CMV-GLS1-3’UTR-mutAREI&II质粒。13.荧光酶素双报告基因实验用于检测AR通过GLS1的3’UTR调节GLS1的表达。14.药物半抑制浓度(IC50)实验用于检测不同细胞系对GLS1选择性抑制剂CB-839的应答。研究结果1.ADT通过降低LNCaP细胞内的代谢物质水平,抑制激素依赖型前列腺癌（androgen-dependent prostate cancer,ADPC）的生长。2.ADT在降低LNCaP细胞中绝大多数代谢物质含量的同时,引起谷氨酰胺在细胞内的大量积聚。3.ADT诱导的谷氨酰胺的积聚是由于其无法被继续分解利用所引起,而非细胞从培养液中的摄取量减少所造成。4.AIPC细胞较ADPC细胞更加依赖谷氨酰胺维持自身生长。5.AIPC细胞较ADPC细胞摄取并消耗更多的谷氨酰胺,且用于三羧酸（TCA）循环提供能量及营养物质的补给。6.GLS1的表达水平随临床分期的进展或病理分级的增加而升高。7.GLS1对AIPC细胞的增殖及侵袭能力有重要影响。8.GLS1的两种剪接体,KGA和GAC,在不同时期的PCa组织中存在差异性表达:ADPC中高表达KGA而AIPC中高表达GAC。9.KGA和GAC的差异性表达是伴随ADPC进展为AIPC的过程中KGA向GAC转换所造成。10.AR通过3’UTR调控GLS1的表达,介导GLS1产生不同的剪接效果:在ADPC中,AR介导GLS1剪接为KGA而在AIPC中AR介导GLS1剪接为GAC。11.GAC是独立于雄激素的剪接体,能够通过增强谷氨酰胺的代谢效应抵抗ADT治疗。12.GLS1选择性抑制剂CB-839可以通过抑制谷氨酰胺代谢途径,抑制AIPC肿瘤的生长。研究结论1.KGA向GAC的转换保证了不同时期的PCa对谷氨酰胺的充分利用,是ADPC进展为AIPC的潜在机制。2.GLS1（GAC）可作为AIPC治疗的新靶点。