基于聚丙烯酰胺反应性温敏聚合物的设计及与蛋白共组裝研究

来源 :北京协和医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhifuhu
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基于聚丙烯酰胺(PAAm)的温敏聚合物具有良好的生物相容性,已广泛应用于细胞黏附、细胞培养、药物递送等领域。温敏聚合物引入反应性基团,将可以连接多肽、靶向载体或药物等,从而拓宽其应用范围。由于聚合物与蛋白的结合能够提高蛋白稳定性,降低其免疫原性,所以探究反应性温敏聚合物与蛋白共组装也在蛋白的捕获、分离、纯化等方面有重要意义。本论文通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合法制备了 2类基于PAAm的反应性温敏共聚物——UCST型和UCST-LCST型,详细研究了它们在水中的温敏性和蛋白共组装能力,并考察了共聚物及其蛋白杂化体对MCF-7,NIH3T3的细胞毒性及细胞摄取情况,初步评估了将其用于蛋白递送领域的可行性。主要研究内容如下:1.以AAm和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)为共聚单体,通过RAFT聚合法合成了不同单体比例的UCST聚合物,得益于NAS部分水解成丙烯酸(AAc),所得到的P(AAm-co-NAS-co-AAc)表现出优异的UCST性能。通过紫外可见分光光度法(UV-vis)和微差扫描量热法(Micro DSC)研究聚合物温敏性,发现随浓度增高相转变温度(Tcp)增高,且在低浓度(0.1 wt%)下具有高Tcp(81℃)。通过荧光共振能量转移效应(FRET)考察聚合物与蛋白的共组装,蛋白浓度测定法(BCA)考察聚合物的蛋白吸附能力,圆二色(CD)和4-硝基苯基乙酸酯法(NPA)考察蛋白二级结构和生物活性。将蛋白混合到聚合物纳米粒溶液中,可形成聚合物-蛋白杂化纳米粒,其能快速捕获蛋白且不改变蛋白二级结构和生物活性。此外,通过CCK-8细胞毒和细胞摄取研究了聚合物及其蛋白杂化纳米粒与细胞的作用情况,发现他们均无明显的细胞毒性,杂化纳米粒还能将蛋白递送到细胞质中。2.以P(AAm-co-NAS-co-AAc)为链转移剂,AAm和N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)为共聚单体,通过RAFT聚合法合成了两类UCST-LCST嵌段共聚物P(AAm-co-NAS-co-AAc)-b-P(AAm-co-NIPAm)及系列对照聚合物。通过 UV-vis 和 DLS 法,发现UCST-LCST嵌段共聚物表现出双重温敏性和可逆核壳转变行为;通过FRET效应、BCA法、CD以及NPA法,发现嵌段共聚物相比于P(AAm-co-NAS-co-AAc)能够形成蛋白负载量更高的杂化纳米粒,还可以在不改变蛋白二级结构和生物活性的前提下提高蛋白变性温度。此外,聚合物及其蛋白杂化纳米粒均无明显的细胞毒性,杂化纳米粒还能将蛋白递送到细胞质中。综上所述,该论文制备了 2种基于PAAm的反应性温敏聚合物(UCST和UCST-LCST型),并可在简单温和的条件下与蛋白共组装。UCST聚合物可在低浓度获得高UCST,且有较高的蛋白负载量;UCST-LCST聚合物可进一步提高蛋白负载量,还增强了蛋白的热稳定性。此类材料有望成为新型蛋白载体,在生物医学领域得到应用。
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