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多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是油田污染土壤中广泛存在的“三致”化合物,油田PAHs的污染土壤通常具有高盐,高pH和PAHs浓度高等特点,将非嗜盐的PAHs高效降解菌引入到盐碱环境中去除PAHs的效果往往不理想。针对盐碱土壤PAHs污染生物修复效率较低的现状,采用中度嗜盐PAHs高效降解菌的生物降解方法日益受到关注,阐明中度嗜盐菌降解PAHs的机理及关键降解酶的催化机制是应用该菌实现生物强化修复的前提。本研究以盐碱条件下能够降解多种PAHs的中度嗜盐菌Martelella sp.AD-3为研究对象,在基因组测序基础上,利用特异性引物克隆了龙胆酸1,2-双加氧酶(Gentisatel,2-dioxygenase, GDO)基因,并实现其在大肠杆菌E.coli21(DE3)中成功诱导表达,经亲和层析纯化重组蛋白GDO,并对其进行了酶学性质的分析；同时通过在高盐度下以PAHs为唯一碳源和低盐度下以甘油为唯一碳源的不同条件下培养AD-3菌,结合Label-Free技术分析不同培养条件下菌株中蛋白的差异表达；最后基于CRISPR-Cas9构建菌株AD-3基因敲除体系,并利用该体系敲除GDO基因。主要结论如下：(1)以AD-3菌基因组DNA为模板,PCR扩增获得1,077 bp的GDO基因,该基因在E.coli21(DE3)中成功表达,纯化的GDO经变性凝胶电泳和非变性凝胶电泳结果显示大小分别约为38 kDa和120 kDa,该结果表明GDO为同源三聚体；GDO在pH 7.0,30℃,盐度12%条件下具有最佳活性,该酶对龙胆酸的Km和kcat值分别是26.64μM和161.29 s-1；基于同位素标记方法,首次发现GDO催化龙胆酸的两个氧原子分别来自于H20和02的加氧机制；利用基因定点突变将GDO中高度保守的四个组氨酸分别突变为不携带电荷的赖氨酸,突变体蛋白全部失活,充分证明了四个组氨酸的重要性。(2)基于差异蛋白质组学分析不同培养条件下AD-3菌的蛋白表达差异,共识别出上调的蛋白187个,与PAHs降解相关蛋白16个,与嗜盐相关的蛋白8个。结合AD-3菌全基因组序列和差异蛋白数据,上调蛋白中与PAHs降解相关的关键酶-PAHs起始双加氧酶的a和p亚基,表达量分别上调149.7倍和41倍；嗜盐相关上调蛋白主要包括相容性溶质甘氨酸甜菜碱合成关键蛋白上调19.1倍,以及甘氨酸甜菜碱转运相关关键蛋白Transpotor ABC上调6.6倍。(3)基于CRISPR-Cas9构建GDO基因的敲除质粒pTC-gdo-3580,将该质粒电转至AD-3菌中,用氨苄抗性筛选获得转化子,经过IPTG诱导获得突变菌株AD-3-pCT-gdo-3590。与野生型AD-3菌能够利用龙胆酸为唯一碳源且观察到明显颜色变化相比,突变株未观察到明显生长和颜色变化,初步证明GDO基因敲除成功,该敲除体系为探索AD-3菌中为更多未知基因功能提供有力的工具。