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慢性光化性皮炎(Chronic actinic dermatitis,CAD)是一种发病率仅次于多形性日光疹的特发性光敏性皮肤病。近年来CAD在亚洲各国发病呈逐年上升趋势,这与环境的恶化,臭氧层空洞的扩大可能存在一定的相关性。由于CAD皮损主要发生于面颈部、四肢等曝光部位,影响患者的心理健康;同时,CAD患者还伴有瘙痒,也给患者带来沉重的精神负担。但迄今为止,CAD的发病机制尚不明确,免疫功能紊乱诱发的迟发型超敏反应与CAD的相关性仍需更多的临床和实验加以证实。因此,CAD的发生和发展是一个复杂的病理过程,可能还存在其他发病机制。MicroRNA(miRNA)是近年来发现的一类保守的长度为19-24个碱基的非编码RNA,广泛存在真核生物体内,其通过与靶基因mRNA 3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)相对应的序列完全或不完全的互补结合,抑制mRNA功能或促进mRNA降解,这些仅占人类基因1%的miRNA分子,却调控着人类三分之一以上基因的表达、修饰、转录和翻译的过程,对细胞增殖、分化及凋亡等生物学功能起着重要的调控作用。越来越多的研究证实,miRNA在多种皮肤病中表达异常,异常表达的miRNA可能发挥调控角质形成细胞、成纤维细胞和黑素细胞凋亡或增殖的作用。miRNA的发现可能成为极有应用价值的分子标志物,为各种皮肤病的早期诊断和预后评估提供新方向。但迄今为止,还没有对CAD组织进行差异表达miRNA的筛选及分析的研究。本课题旨在阐明CAD组织miRNA表达谱及差异表达miRNA对CAD生物学行为影响及调控作用。研究内容包括以下3部分:第一部分慢性光化性皮炎组织差异表达miRNA的筛选目的:筛选出CAD组织中的差异表达的miRNAs,获得CAD miRNA表达谱。方法:收集3例CAD患者的皮损和3例健康对照者皮肤组织,提取RNA,应用Agilent miRNA芯片,筛选出CAD组织中的差异表达miRNAs,采用实时定量PCR(qRT-PCR)在10例CAD患者的皮损和10例健康对照者皮肤组织样本中进行进一步验证。并通过Cytoscape、DAVID等相关工具对差异表达miRNA的靶基因进行预测和功能分析。结果:1.对3例患者组织和3例健康者组织的总RNA抽取及质检。结果显示,所提取的总RNA的电泳可见28s和18s条带,A260/A280比值都介于1.8-2.2之间,RNA检测结果符合芯片杂交实验要求。2.miRNA芯片结果显示:CAD组织与健康者组织存在有显著差异表达的miRNAs:有18个miRNAs表达上调,16个miRNAs表达下调。3.采用qRT-PCR方法对上调的5个miRNAs进行验证,结果显示与芯片结果趋势一致。4.差异表达miRNAs的靶基因可能参与PI3K/Akt等信号通路,并与细胞增殖相关。结论:miRNA表达谱芯片可用于分析CAD组织miRNA表达谱;通过Agilent miRNA芯片筛选结合qRT-PCR验证,共得到18个显著上调,16个显著下调的miRNAs,为下一步开展CAD组织miRNA功能学研究提供了实验基础。第二部分miRNA-21的细胞生物学功能研究目的:探讨miRNA-21的细胞生物学功能。方法:人工合成miRNA-21的模拟物mimic及抑制物inhibitor,分别转染至人HaCaT细胞中。设置空白对照组,通过PCR检测转染效率;采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)实验和EdU实验对比转染前后细胞增殖能力;流式细胞学对比转染前后细胞凋亡情况。结果:1.PCR显示,miRNA-21 mimic可以使HaCaT细胞miRNA-21表达上调;miRNA-21 inhibitor可以使HaCaT细胞miRNA-21表达下调15倍以上。2.miRNA-21对HaCaT细胞生物学行为的影响。(1)CCK8法检测细胞增殖实验:分别在(12h、24h、36h、48h、72h)5个时间点行CCK8检测HaCaT细胞的OD值,结果显示,相对于对照组细胞,转染了 miRNA-21 mimic的HaCaT细胞增殖活性均增加(P<0.05)。(2)EdU实验检测细胞增殖能力:EdU结果显示,相对于对照组细胞,转染了 miRNA-21 mimic的HaCaT细胞增殖活性均升高(PP<0.05)。(3)流式细胞术检测细胞凋亡:对miRNA-21转染48h后的HaCaT细胞进行流式细胞术细胞凋亡分析,结果显示,miRNA-21 mimic组凋亡率明显低于NC组(P<0.05)。结论:miRNA-21 mimic可促进CAD细胞的增殖,抑制细胞凋亡,表明miRNA-21可能参与CAD的发生发展。第三部分miRNA-21对HaCaT细胞生物学行为调控的机制研究目的:预测并验证miRNA-21的靶基因,初步探讨miRNA-21调控PI3K/Akt通路参与HaCaT细胞功能的生物学机制。方法:通过 TargetScan、picTar、RNA22、PITA 及 miRanda 等 miRNA 靶基因预测数据库,在线预测miRNA-21可能的靶基因。在细胞水平和组织水平通过Western blot(WB)、萤光素酶报告基因实验、拯救实验验证miRNA-21可能的靶基因及参与的信号通路。结果:1.预测miRNA-21的靶基因:通过miRNA靶基因预测数据库预测miRNA-21的靶基因,三个及以上软件交集的miRNA-21靶基因共150个;最后选择5个靶基因作为miRNA-21的可能靶基因来进一步研究。2.细胞水平验证靶基因是否为miRNA-21的靶基因:miRNA-21 inhibitor组3个相关蛋白表达量高于NC组,差异有统计学意义(P<0.05),而miRNA-21 mimic组3个相关蛋白表达量均低于NC组(P<0.01),表明miRNA-21能调控HaCaT细胞中3种蛋白的表达。3.组织水平进一步验证3种蛋白的表达,发现PTEN在CAD皮损中表达下调,与细胞水平结果一致。4.将PTEN mRNA3’ UTR420-437nt及突变片段克隆至质粒,细胞转染后,分别过表达和抑制miRNA-21的表达。萤光素酶报告基因分析发现miRNA-21调控该位点明显影响了报告基因的表达,因此miRNA-21靶向PTEN 3’UTR并调控其表达。5.在“拯救”实验中,miRNA-21 inhibitor与针对PTEN_siRNA不同组合转染HaCaT细胞,观察PTEN的表达以验证靶基因。结果发现,与转染miRNA-21 inhibitor 相比,miRNA-21 inhibitor 与PTEN siRNA共转染后,HaCaT 细胞 PTEN表达明显下降;因此在HaCaT细胞,miRNA-21靶向PTEN并调控其表达。6.miRNA-21通过靶向PTEN对PI3K/Akt信号通路的影响:与未转染组相比,转染miRNA-21 inhibitor HaCaT细胞PTEN表达明显下降,p-AKT表达升高;因此在HaCaT细胞,miRNA-21可能靶向PTEN并调控AKT的表达。结论:miRNA-21可能通过直接调控HaCaT细胞PI3K/Akt信号通路中关键分子PTEN及Akt激活PI3K/Akt信号通路。