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为了建立高效的犊牛体外胚胎生产技术,本研究通过比较不同超数排卵方案、不同月龄犊牛、重复超排对荷斯坦奶牛犊牛超数排卵效果的影响;对超排获得的犊牛卵母细胞和成年母牛卵母细胞的体外成熟、体外受精及早期胚胎发育潜能进行了比较;同时探讨了采卵时间(最后一次FSH到手术采卵之间的时间间隔)对犊牛卵母细胞回收率及卵母细胞质量的影响;并对犊牛卵母细胞体外成熟和胚胎体外培养进行了初步探讨。
(1)采用5种超数排卵方案处理同月龄犊牛,结果发现:(FSH)25mg/头,次,肌注一天两次,间隔12h,连续注射4天,最后一次FSH隔24h采卵的超排方案,所得头均采集卵泡数(97.3+23.5个)和头均可用卵数(43.7+-9.7枚)显著高于其他方案(P<0.05)。对比1~6月龄犊牛的超数排卵效果,结果发现2~6月龄犊牛组之间的头均采集卵泡数和可用卵数差异不显著(P<0.05),2~5月龄犊牛组头均采集卵泡数和可用卵数均显著高于1月龄组(P<0.05),6月龄犊牛组与1月龄组之间差异不显著(P>O.05)。分析了重复超数排卵间隔时间对犊牛第二次超排效果的影响,发现第二次超排的头均采集卵泡数和可用卵数均显著低于第一次(P0.05),但均显著高于间隔2周组(P<0.05)。
(2)4种超排方案所回收犊牛卵母细胞的体外成熟率和受精后卵裂率差异不显著(P>O.05)。2~6月龄之间犊牛卵母细胞体外成熟率和受精后卵裂率差异不显著(P<0.05)。无论是来自于不同超排方案还是不同月龄的犊牛卵母细胞的体外成熟率、受精后卵裂率和胚胎体外发育能力均显著低于成年牛(P<0.05)。
(3)采卵时间为间隔30h时,犊牛卵母细胞的回收率和成熟率显著高于间隔24h组(P<0.05),极显著高于间隔18h组(P<0.01);但可用卵率显著低于间隔24h组和18h组(P<0.05)。
(4)用成熟液M1(TCM-199+5mmol/L Hepes+0.51ag/mL FSH+5μg/mL LH+llag/mL17-β-E2+15% FBS)对犊牛卵母细胞进行体外成熟培养24h,卵母细胞的成熟率和受精后的卵裂率均显著高于M和M2成熟液组(P<0.05)。
(5)犊牛胚胎从体外受精后到囊胚孵化所需的时间显著比成年牛长(13.4+1.1天vs8.2+0.8天,P<0.05)。犊牛孵化囊胚的直径显著小于成年牛(276.3+4-35.lμm vs472.8士81.6μm,P<0.05)。犊牛孵化囊胚的细胞数也明显比成年牛少(97.2+15.4个vs207.3+34.1个,P<0.05)。