耐寒种质的培育与应用一直是植物学领域的研究重点,但研究对象主要局限在粮食作物以及主要经济作物中,研究方法则大多集中在传统育种技术上,很少有利用基因工程等现代育种技术对观赏花卉耐寒新种质的创制进行深入研究的报道。矮牵牛（Petunia hybrida）隶属于茄科（Solanaceae）碧冬茄属（Petunia）,是花坛及露地园林绿化中应用最广的观赏花卉,且在分子生物学中被作为模式植物,但其不耐寒,当温度低于15℃时,会导致晚花或不开花,同时在北方冬季的低温环境下难以露地越冬,这对其推广和应用造成了阻碍。百合（Lilium spp.）隶属于百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）,为世界十大切花之一,其切花产值高,兼具观赏性、食用性及药用价值,其中麝香百合（Lilium longiflorum）是百合育种中的一种重要野生花卉,萌芽时能耐0℃左右的低温,但在花芽分化完成后,如遇12℃以下的低温则容易导致盲花,严重影响其切花品质。为打破矮牵牛和麝香百合应用范围的地域限制并实现花卉周年化供应,开展创制其耐寒新种质的工作已迫在眉睫。目前,通过转基因技术来实现植物耐寒性的定向改良,被认为是最有效的育种手段。在与抗寒性相关的候选基因中,DREB1/CBF转录因子（Dehydration responsive element binding protein 1/C-repeat binding factor）是一类在模式植物低温信号传导网络中起关键作用的基因,其隶属于AP2/ERF家族中的DREB亚族,且能激活下游一系列冷调节基因的表达。因此,本研究中以腋花矮牵牛和麝香百合为研究对象,根据相应的基因组和转录组数据,筛选和克隆了不同物种来源的DREB1s/CBFs基因,并进行了一系列的表达分析、转基因和抗寒性鉴定实验,发现两个物种中DREB1/CBF同源基因过表达均具有提高拟南芥基础抗寒性的能力,同时超量表达部分矮牵牛来源的DREB1/CBF基因不仅能提高矮牵牛植株的抗寒性,还能改变矮牵牛植株的园艺性状,且所获得的矮牵牛耐寒新种质具备潜在的应用价值,主要研究结果如下:1.利用腋花矮牵牛基因组和麝香百合逆境转录组的序列信息,设计特异引物,分别克隆出了11条腋花矮牵牛和5条麝香百合DREB1/CBF的同源基因,上述16条基因的g DNA与c DNA碱基序列完全相同,均没有发现内含子的存在,且c DNA能编码长度范围在201-242个之间的氨基酸。序列分析结果表明这16条DREB1s/CBFs转录因子均包含了典型的保守序列,如AP2结合域、核定位信号、DSAWR以及LWSY等。系统进化分析结果表明,这16条DREB1s/CBFs转录因子均归属于DREB亚族中的A-1亚组分枝,其中腋花矮牵牛及麝香百合中的大多数成员分别位于A-1亚组分枝的顶端与底端,其进化地位差异较大;2.利用半定量RT-PCR分析了在不同非生物胁迫条件下,腋花矮牵牛及麝香百合中DREB1s/CBFs同源基因的时空表达模式,结果表明在腋花矮牵牛不同组织部位中,除Pa DREB1K基因仅在根中应答低温外,大部分Pa DREB1s/CBFs成员在低温处理后的叶片、花芽和果实中都有表达。而在不同非生物胁迫条件下,Pa DREB1D、Pa DREB1F、Pa DREB1G、Pa DREB1I和Pa DREB1J基因只单一应答低温胁迫,Pa DREB1A、Pa DREB1B和Pa DREB1E基因能应答低温、干旱和高盐胁迫,Pa DREB1H基因能应答低温和高盐胁迫,Pa DREB1C基因能应答低温、高温、干旱和ABA处理,Pa DREB1K基因能应答干旱、高盐和H2O2胁迫;在麝香百合不同组织部位中,Ll DREB1A、Ll DREB1B和Ll DREB1E基因在低温处理后的根中检测到了表达,大部分Ll DREB1s/CBFs成员在低温处理后的叶片和小鳞茎中均都有表达。而在不同非生物胁迫条件下,麝香百合中5个Ll DREB1s/CBFs基因均能响应3种以上的不同非生物胁迫,且不存在只单一应答低温胁迫的成员,这说明了与Ll DREB1s/CBFs成员相比,腋花矮牵牛中Pa DREB1s/CBFs基因不同成员之间的表达模式差异更大。同时还利用q RT-PCR进一步检测了上述16条基因在低温胁迫下的表达峰值,发现与Pa DREB1s/CBFs成员相比,更多Ll DREB1s/CBFs成员受低温诱导的持续表达时间较长,且在胁迫处理后期表达水平下降的速率较慢,而不同物种间DREB1s/CBFs基因表达峰值的差异可能会影响它们受低温诱导的持续表达时间;3.根据上述DREB1s/CBFs基因的表达模式和系统进化分析结果,我们从16条DREB1s/CBFs基因中挑选了4条低温应答模式有明显区别或进化地位明显特殊的基因,分别构建了35S::Pa DREB1E、35S::Pa DREB1H、35S::Pa DREB1J和35S::Ll DREB1B超量表达载体,并同时转化了拟南芥和矮牵牛。通过对转基因拟南芥的表型观测,结合生理指标测定及下游At CORs基因的q RT-PCR分析,发现Pa DREB1E、Pa DREB1H、Pa DREB1J和Ll DREB1B基因过表达株系的基础抗寒性均显著强于野生型,这说明所挑选的4条DREB1s/CBFs基因都适用于植物抗寒性状的改良,可以作为后续创制矮牵牛和麝香百合耐寒新种质的目的基因。此外,通过对冷驯化组和非冷驯化组中矮牵牛植株的表型观测,生理指标测定及下游组分Ph DHN2和Ph DHN10基因的q RT-PCR分析,发现在非冷驯化组中超量表达Pa DREB1E与Pa DREB1J基因均能增强矮牵牛的基础抗寒性,转基因株系中脯氨酸和糖类的含量都显著高于野生型,这揭示了Pa DREB1E与Pa DREB1J基因在提高矮牵牛基础抗寒性中可能存在功能冗余,此外过表达Pa DREB1E、Pa DREB1H、Pa DREB1J及Ll DREB1B基因均能够显著上调非冷驯化组中Ph DHN2和Ph DHN10基因的表达（35S::Ll DREB1B株系中的Ph DHN2基因除外）。同时在冷驯化组中超量表达Pa DREB1J基因也能增强矮牵牛的获得性抗寒性,与野生型相比,转基因株系中糖类的含量显著增加,但脯氨酸的含量没有明显增加,此外仅过表达Pa DREB1J基因能够显著上调冷驯化组中Ph DHN2和Ph DHN10基因的表达;4.以麝香百合鳞茎薄层切片为转化受体材料,通过农杆菌介导法将Ll DREB1B基因导入到麝香百合中,共获得了20棵抗性植株,经过PCR初步检测,其中有12棵可能为阳性植株。此外半定量RT-PCR分析表明与野生型相比,转基因麝香百合植株中Ll DREB1B基因的表达量显著较高;5.在组成型表达Pa DREB1E、Pa DREB1H、Pa DREB1J和Ll DREB1B基因的大部分矮牵牛植株中观察到了显著的开花推迟现象,并且伴随着分支数及可见花芽数的明显减少。通过q RT-PCR检测了可能与开花延迟相关的Ph FT1和Ph MADS17-like基因的表达水平,结果发现与野生型相比,Ph FT1和Ph MADS17-like基因的表达量在转基因株系中明显较高。