论文部分内容阅读
水牛与黄牛相比,耐粗饲能力更强。木质素是阻碍反刍动物对粗饲料中半纤维素和纤维素充分利用的重要因素。前期研究结果表明水牛瘤胃内微生物对木质素具有降解能力。因此,研究瘤胃微生物对木质素降解通路能够进一步阐明水牛耐粗饲的原因。本研究以水牛瘤胃内容物中分离的1株真菌为研究对象,经初步鉴定为烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus),通过检测其木质素降解能力和木质素降解酶的酶活、筛选可编码木质素降解酶的功能基因、分析主要的木质素降解产物及其代谢通路,对进一步探究该菌株对木质素的降解机制,揭示水牛耐粗机理具有重要意义。(1)Aspergillus fumigatus降解木质素的能力和木质素降解酶的酶活测定:本实验从菌株形态特征\生理生化特性\ITS rRNA(Internal Transcribed Spacer)序列和28S rRNA序列鉴定该菌株为Aspergillus fumigatus。检测其对木质素磺酸钠的降解能力,降解率最高可达15.12%。检测其分泌的木质素降解酶,只检测出阿魏酸酯酶的活性,在120h时达到最高为0.033U/mL。(2)Aspergillus fumigatus编码木质素降解酶的功能基因筛选及其降解木质素的通路预测:利用第三代PacBio RS II平台检测Aspergillus fumigatus的全基因组序列,并对木质素降解基因进行鉴定和生物信息学分析。在外源蛋白CAZyme数据库的辅酶(auliliary enzyme,AA)中,共筛选出29个木质素降解酶基因,包括多铜氧化酶、木质素修饰过氧化物酶、葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶、香草醇氧化酶、半乳糖氧化酶、1,4-苯醌还原酶、单加氧酶和阿魏酸酯酶。设计这些基因特异性引物,进行PCR验证,成功克隆出这29个基因的片段。将这些基因进行KEGG代谢通路分析,共有12个基因已注释到代谢通路中:1个基因富集到半乳糖代谢通路,1个基因富集到苯丙氨酸代谢通路,4个基因富集的通路则为丙酮酸代谢,另外6个基因注释到未分类的代谢通路。这些代谢通路与Aspergillus fumigatus降解木质素密切相关。(3)Aspergillus fumigatus降解木质素的主要产物及代谢通路研究。GC-MS检测分析木质素降解产物,共鉴定出182种物质,分别为65种酸类物质、38种氨基酸类物质、23种糖类物质、16种苯环类物质、15种醇类物质、12种胺类物质、5种酯类物质、4种酮类物质、4种嘧啶物质、3种酚类物质、2种盐类、2种吡啶物质和1种醛类物质。差异代谢产物共有75种,其中与对照组相比,实验组共发现5-氨基戊酸、附子酸、芴、莽草酸等12种新产物;在对照组和实验组均存在的物质中,有3,4-二羟基苯甲酸、2-羟基苯乙酮、3-羟基苯甲酸、麝香草酚、富马酸、丙酮酸等52种差异代谢产物随降解时间的延长呈上升趋势;有肌醇半乳糖苷、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷、甘氨酸和3-羟基-L-脯氨酸2共4种差异代谢产物随降解时间延长呈下降趋势和其它苯甲酸、丙酮酸、乳糖酸、甘露醇、N-甲基DL-丙氨酸、4-羟基丁酸酯和木糖共7种差异代谢产物无明显变化趋势。其中富马酸富集到丙酮酸和苯丙氨酸代谢通路,3-羟基苯甲酸和3,4-二羟基苯甲酸均富集到苯甲酸盐和甲苯代谢通路,3,4-二羟基苯甲酸还富集到氨基苯甲酸代谢通路,其它差异代谢产物苯甲酸富集的通路有苯丙氨酸代谢、苯甲酸盐降解、甲苯降解和氨基苯甲酸降解等。这些降解通路可能与Aspergillus fumigatus降解木质素相关。研究结果证实Aspergillus fumigatus具有降解木质素能力。结合酶学分析、功能基因筛选、降解产物GC-MS分析及代谢通路分析,表明Aspergillus fumigatus降解木质素的代谢通路主要有6种,分别为半乳糖代谢、苯丙氨酸代谢、丙酮酸代谢、苯甲酸盐降解、甲苯降解和氨基苯甲酸降解。