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研究目的:探讨裂果薯总皂苷(TSSPH)对肝星状细胞的活化和抗大鼠肝纤维化作用,从体内体外初步阐明TSSPH抗大鼠肝纤维化的调控机制。研究方法:1.利用肝星状细胞株研究TSSPH对肝星状细胞活化的影响:MTT法检测TSSPH对肝星状细胞毒性以及计算半数抑制浓度(IC50);Hoechst33258荧光染色观察TSSPH对鼠肝星状细胞HSC-T6细胞的凋亡诱导作用;Western bloting法检测TSSPH对HSC-T6细胞凋亡相关蛋白、Bcl家族相关蛋白的表达的影响;流式细胞技术检测TSSPH对肝星状细胞的凋亡率;2.应用灌胃四氯化碳法建立的大鼠肝纤维化模型研究TSSPH的抗肝纤化作用:ELISA法检测TSSPH对肝纤维化大鼠血清四项肝纤维化标志物(HA、LN、CⅣ、PCⅢ)的影响;全自动生化分析仪检测大鼠肝功能水平;样本碱水解法检测肝组织羟脯氨酸(Hyp)的含馈;应用HE、Masson染色评价纤维化大鼠肝脏病理损伤;应用透射电镜法观察肝细胞超微结构;3.利用肝纤维化大鼠肝组织样本和HSC-T6细胞研究TSSPH对TGF-β1/Smad信号通路的影响:免疫组化法检测TSSPH对肝组织α-SMA、TGF-β1等细胞因子蛋白水平的表达及信号通路中Smad7、Smad2/3等蛋白水平的变化;实时荧光定量法检测TSSPH对胶原成分平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长-β1(TGF-β1)等细胞因子mRNA水平的表达及信号通路中Smad7、Smad4等mRNA水平的变化;应用Western bloting检测TSSPH对HSC-T6细胞中TGF-β1/Smad信号转导通路相关蛋白Smad7和Smad2/3等蛋白的表达变化;研究结果:1.TSSPH能有效抑制大鼠HSC-T6细胞的增殖,并且还能诱导HSC-T6细胞凋亡及发生caspase级联反应MTT实验结果显示,TSSPH对HSC-T6 IC50值为3.841μg/mL;Hoechst 33258染色结果显示,TSSPH具有诱导HSC-T6细胞凋亡的作用;流式细胞术结果显示,TSSPH作用HSC-T6 24h,HSC-T6凋亡率明显增加,与空白对照组相比,TSSPH4、6μg/mL组HSC凋亡率均显著升高。表明TSSPH对HSC-T6有一定的促凋亡和转变致坏死的作用;蛋白表达检测结果同样显示,与空白对照组比较,TSSPH干预组Bax蛋白表达增加,TSSPH干预后使凋亡相关因子Bcl-2、caspase3、Caspase9的蛋白表达均显著降低。2.TSSPH能够减少胶原含量并改善降低肝纤维化标志物指标,明显减轻肝组织纤维化程度TSSPH组大鼠肝脏指数与模型组相比明显降低(P<0.01);TSSPH能够降低肝纤维化大鼠血清中AST、ALT的水平,TSSPH高剂量组最为明显(P<0.05),作用明显优于秋水仙碱组;模型组大鼠血清中肝纤四项指标(HA、LN、CⅣ、PCⅢ)的含量及羟脯氨酸水平较正常对照组有显著性升高(P<0.01,P<0.05);在TSSPH干预组实验动物中,我们也发现在给药干预4周后,大鼠血清样本中纤维化指标含量较纤维化模型组显著性降低(P<0.01,P<0.05),胶原含量减少;病理结果显示:模型组大鼠肝细肝索排列紊乱,大量胶原纤维增生,形成纤维桥连接,并且把肝小叶分割,肝纤维化病理损伤程度较正常组显著加重(P
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