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研究背景:作为获得天然细胞外基质的一种新方法,脱细胞技术是指去除细胞抗原,而保留了组成细胞外基质的结构和功能蛋白。来源于脱细胞组织的的细胞外基质在组织工程和再生医学上广泛地研究应用。我们前期研究,用改进的联合物理和化学的脱细胞方法,得到了脱细胞的软骨细胞外基质(articular cartilage extracellular matrix ACECM),并利用冷冻干燥技术制备了多孔支架。体内外的研究表明:ACECM保留了软骨基质的蛋白多糖(glycosaminoglycans GAGs)和Ⅱ型胶原蛋白(type II collagen)成份,提供空间结构和良好的细胞相容性,利于骨髓间充质干细胞(MSCs)的粘附、分化和成软骨分化。然而,天然来源的生物材料缺乏足够的力学强度,尤其在含水状态。ACECM支架材料也是如此,抗张力和抗压缩强度低。而理想的软骨支架应该具有结构的完整性,体内承载天然软骨的功能性压应力负荷。组织工程和再生医学的目的是恢复原始修复组织的结构和功能。支架的生化组成和结构功能关系对于优化力学和生物学功能至关重要。支架的形态结构能够仿生所修复的组织很有意义。关节软骨的胶原纤维有着明显的分区排列结构,影响软骨的抗张力和抗压缩特性。深层软骨的胶原纤维取向性的垂直与软骨下骨排列。所以,垂直取向结构的支架与软骨的生理学和生物力学功能密切相关。各种合成的材料(PCL, PLGA, PLA)具有良好的生物相容性和力学强度,广泛应用于组织工程。然而其表面疏水、缺乏利于细胞粘附的生物活性。天然和合成材料具有各自的优缺点,它们的复合支架可以优势互补。合成和天然材料组成的复合支架具有良好的细胞亲和性和力学强度而广泛应用于软骨组织工程。然而,制备功能性和仿生性的支架仍然是很大的挑战。本实验,制备了取向性的PLGA/ACECM的复合支架。体外评价该复合支架的细胞亲和性和力学性质。同时,自体MSCs加载在该支架上,植入到兔膝关节内。再生的关节软骨行组织学染色和大体评价、观察。更有意义的是:取向性的PLGA/ACECM复合支架,能否引导关节软骨的垂直取向再生;能否诱导MSCs向软骨细胞方向分化,有待研究证实。第一部分仿生性关节软骨细胞外基质取向支架的制备及表征目的:1.制备纳米级关节软骨ECM。2.制备ACECM取向支架。3.评估纳米级ACECM和ACECM取向支架方法:联合物理和化学方法对关节软骨脱细胞处理。猪膝关节软骨片悬浮在PBS中,用组织匀浆机的强大剪切力均匀处理而形成悬浮浆料,然后差数离心。ACECM沉淀用3% TritonX-100和胰酶先后消化脱细胞,DNA和RNA酶去除核物质。用热诱导的相分离技术制备ACECM取向支架。ACECM浆料和取向支架用电镜观察。支架的生化组成以组织学定性分析。结果:脱细胞的ACECM呈纤维状的纳米结构。免疫组化证明软骨特异性collagen II的存在,番红O阳性染色证明了GAGs的存在。多孔结构及垂直取向结构排列分布均匀。结论:联合物理和化学脱细胞方法制备了纳米级ACECM。热诱导相分离技术制备了取向性的ACECM支架。ACECM取向支架仿生了深区软骨的生化组成和形态结构。第二部分骨髓间充质干细胞复合ACECM取向支架的体外评估及裸鼠皮下异位成软骨的实验研究目的:1.评估ACECM的生物相容性。2.观察取向性结构对MSCs生长排列的影响。3. ACECM支架加载软骨诱导的MSCs裸鼠皮下异位构建组织工程软骨。方法:分离,扩增和软骨诱导MSCs接种到取向支架上,电镜下观察细胞生长。CCK-8试剂盒量化分析细胞增殖。死活细胞染色评估细胞活力。软骨诱导分化的MSCs以PKH26荧光标记后裸鼠皮下植入。4周后,活体荧光成像系统分析植入物。植入物组织学染色分析。结果:MSCs沿着垂直取向结构聚集排列充满孔间隙。细胞增殖迅速;除少量死细胞,绝大部分为活细胞粘附在支架上。PKH26有效地标记了MSCs,荧光成像证明:植入物来源于PKH26标记的细胞-支架结构。组织学染色证明:类软骨样细胞增殖,新的软骨基质分泌,ACECM维持了分化MSCs的软骨表型,在体内形成了类软骨样组织。结论:ACECM提供微环境利于MSCs粘附增殖。接种的细胞沿着取向结构排列。PKH26荧光标记的MSCs体内得到追踪,ACECM在体内维持MSCs的软骨分化能力。第三部分仿生PLGA/纳米ACECM复合取向支架的制备及体外评估目的:1.制备PLGA/ACECM取向复合支架。2.评估取向支架的力学强度。3.评估复合支架的细胞活性。方法:支架制备方法与制备ACECM取向支架相同。支架在干燥和湿润状态下的力学分析采用测试压缩模量的方法进行。细胞增殖和活性分别采用CCK-8和死活染色的方法。结果:取向复合支架的结构与单存ACECM支架相似。在干燥状态下,复合支架的压缩模量为4.20±0.17 MPa,ACECM支架为2.20±0.17 MPa。在湿润状态下,ACECM支架仅为0.11±0.01 MPa,而复合支架为1.03±0.1 MPa。复合支架的细胞增殖性和活性要优于PLGA支架。结论:用热诱导相分离技术制备了PLGA/ACECM取向复合支架。该支架具有良好的亲水性和细胞亲和性。复合支架较ACECM支架有更高的力学强度,尤其在含水状态下。第四部分自体骨髓间充质干细胞复合PLGA/ACECM取向支架修复兔膝关节软骨缺损目的:1.复合取向支架修复软骨缺损。2.取向性的复合支架引导软骨取向性再生。3. ACECM在体内能够诱导MSCs向软骨方向分化。方法:取向性的复合支架加载自体MSCs后,植入到兔的关节软骨缺损区,以单纯支架和空白旷置作为对照组。术后12W和24W后,修复的软骨以组织学和免疫组化分析评估。结果:术后24W,软骨缺损以透明软骨修复。再生的关节软骨沿着垂直取向排列。结论:PLGA/ACECM复合支架能够修复兔膝关节软骨缺损。取向性的PLGA/ACECM复合支架能够引导取向性的关节软骨再生。ACECM在体内能够诱导MSCs分化成软骨细胞。