第一部分胆囊癌转移相关miRNAs的高内涵筛选及功能和机制研究研究背景和目的胆囊癌是胆系恶性肿瘤中最常见的肿瘤，近年来其发病率上升较快，其发病率在胃肠道肿瘤里占第5位。胆囊癌被认为是侵袭性和致死性最高的恶性肿瘤之一，其较强的侵犯特性使得胆囊癌即使行外科手术切除后预后也非常差。早期胆囊癌无症状或仅有上腹部不适感，发病隐匿，诊断困难，常被忽视或漏诊，至晚期可出现腹痛、黄疸及消瘦等症状，但多数患者已无手术机会，进展期胆囊癌预后效果较差，术后5年存活率约为5%。近几十年来关于胆囊癌的研究有了一定的进展，但是胆囊癌高转移、高侵袭特性的分子机制尚未被完全阐明。microRNA（miRNA）是一种只有18-22个碱基左右的小分子非编码RNA，通过转录后调控机制影响基因表达。miRNA几乎参与了与肿瘤相关的所有过程，包括增殖、分化、凋亡、转移、血管生成、免疫应答等，并且功能研究表明其在肿瘤中起着致癌或者抑癌基因的作用，在肿瘤的诊断、发生发展、预后中具有重要的意义。但是目前关于miRNA在胆囊癌中的相关研究未有系统报道。miR-20a定位在染色体13q31，是miRNA17-92簇的成员之一。研究表明17-92簇的miRNAs成员在多种肿瘤里起着癌基因的作用。但是，miR-20a却鲜见研究和报道。本研究从高内涵筛选出发，系统性筛选胆囊癌转移相关的miRNAs，筛选出包含miR-20a在内的17个miRNAs，继而通过胆囊癌、癌旁差异性表达确定miR-20a为研究对象，在胆囊癌细胞株、稳定表达细胞系和动物水平研究miR-20a的促进肿瘤生长和促进肿瘤转移功能，继而通过生物学预测的方法去研究miR-20a的靶基因，通过多种生物学方法确定Smad7为miR-20a的靶基因，然后明确Smad7在miR-20a促进胆囊癌生长和转移中的依赖作用，进一步阐明Smad7通过影响β-catenin的转录活性和下游基因的表达是miR-20a促进胆囊癌生长、转移的分子机制，并结合临床样本明确miR-20a和Smad7在胆囊癌中的预后作用。实验方法1.通过高内涵成像和分析系统，用人的miRNAs库mimics转染胆囊癌细胞系GBC-SD，通过F-actin染色，筛选出胆囊癌转移相关的miRNAs；2.通过Real-tim PCR和miRNA原位杂交的方法检测胆囊癌冰冻组织、正常胆囊粘膜组织中17个转移相关的miRNAs的差异性表达，确定miR-20a为最终的研究对象。3.体内观察抑制miR-20a后胆囊癌生长和转移特性的变化：（1）miR-20a和胆囊癌生长特性的关系——裸鼠皮下荷瘤模型；（2）miR-20a和胆囊癌转移和侵袭的关系——脾脏注射肝转移模型。4. miR-20a的靶基因的确定：miRanda and TargetScan等生物学预测工具寻找可能的靶基因、 pGLO-Smad7dual luciferase report gene assay检测miR-20a对靶基因3’UTR的binding作用、Western blot和Real-time PCR检测miR-20a在蛋白和mRNA水平对靶基因的抑制作用，Real-time PCR检测在胆囊癌和裸鼠皮下荷瘤模型样本中Smad7和miR-20a的表达以及相关性。5. Smad7在胆囊癌中的作用：（1）Smad7在胆囊癌和正常胆囊组织中的表达情况：Real-time PCR，免疫组化；（2）Smad7对胆囊癌细胞生长中的影响——CCK8assay；（3）Smad7对胆囊癌细胞转移和侵袭的影响：Transwell assay、Matrigel assay、Western blot、Real-time PCR。6. Smad7作为miR-20a的直接靶基因在miR-20a的生物学功能中的作用（1）Smad7在miR-20a对胆囊癌细胞促生长中的作用——Smad7表达质粒和miR-20a共转染后进行CCK8assay；（3）Smad7在miR-20a对胆囊癌细胞促转移和侵袭中的作用：Smad7表达质粒和miR-20a共转染后进行Transwell assay、Matrigelassay、Western blot。7. Smad7下游靶基因β-catenin的相关研究：（1）miR-20a、Smad7对β-catenin转录活性的影响——β-catenin报告基因活性检测、β-catenin蛋白核转位Western blot检和免疫荧光检测；（2）β-catenin转录活性在胆囊生物学功能中的作用——LiCl刺激胆囊癌细胞后Transwell assay、Matrigelassay、Real-time PCR检测。8. miR-20a及靶基因在临床样本中和预后的关系：miRNA原位杂交检测miR-20a在石蜡样本中的表达、免疫组化检测Smad7基因等。9. miR-20a诱导的Smad7抑制在TGF-β1通路中的作用：Transwell assay、Matrigelassay、Western blot等。实验结果1.通过人类miRNA库mimic转染胆囊癌细胞进行F-actin测定的高内涵系统筛选出17个可以明显上调F-actin的miRNAs，即胆囊癌转移相关miRNAs。通过胆囊癌差异性表达检测确定miR-20a为核心的胆囊癌转移相关miRNA；2. miR-20a过表达通过上皮细胞间制化促进胆囊癌细胞的转移、侵袭，并促进胆囊癌细胞的生长；3.动物模型证实抑制miR-20a可以明显抑制胆囊癌的生长和转移；4. Smad7被证实为miR-20a的直接靶基因；5. Smad7在胆囊癌中起抑癌基因作用，并且其在miR-20a的促癌作用中起关键作用；6. Smad7通过影响β-catenin的转录活性发挥作用；7. miR-20a的过表达和胆囊癌患者的生存明显呈负相关；8. TGF-β1可以诱导miR-20a表达升高，miR-20a在TGF-β1诱导的EMT过程中起重要作用。结论本研究通过高内涵的方法筛选出了和胆囊癌转移相关的miRNAs，体内外证实miR-20a通过靶向Smad7在胆囊癌的转移和生长中起关键作用，miR-20a过表达、Smad7低表达患者有较差的预后，结果提示：干预miR-20a可能成为胆囊癌治疗的重要部分。第二部分自噬在肝母细胞瘤中的功能和机制研究研究背景和目的肝母细胞瘤是3岁以下儿童最常见的肝脏恶性肿瘤，占全部儿童恶性肿瘤的1%，占小儿肝脏恶性肿瘤的90％。约70%的儿童在发现肿瘤时可以成功切除，早期的肝母细胞瘤可以有约90%的1年生存率和65%的5年生存率。辅助化疗和肝移植术为肝母细胞瘤提供了手术切除意外的保障。其发生发展是多因素综合作用的结果，包括基因组和环境等因素。近年来，研究表明染色体11p15区的缺失突变，IL-1β和IL-6，β-catenin/Wnt通路的异常等都和肝母细胞瘤密切相关。但是该肿瘤机制尚未完全明了，治疗和预后仍面临诸多问题。自噬是一种革命性的新发现，它是生物体内一种相对保守的对物质进行分解代谢的过程，在清除无用的、累积的蛋白质聚集物、多余的或癌变的细胞，维持机体内环境稳态方面发挥重要作用。自噬调控机制的失调与多种疾病的发生发展相关，如神经变性性疾病、自身免疫病、恶性肿瘤、衰老、病原微生物感染、肌细胞功能失调等。近几年自噬有了较大的发展，多种自噬相关基因(ATGs)被发现，但对其深层次机制的认识上尚需进一步的研究和发现。近年来研究表明，自噬和多种肿瘤的发生发展有密切联系。但是目前其对肿瘤是保护还是抑制作用是有较大分歧的，可以认为自噬抑制肿瘤的发生，却促进了肿瘤的进展。在某些肿瘤中，自噬减弱最终会导致癌基因的突变和对肿瘤的易感性。如鼠的BECN1经过断裂突变处理后发现淋巴瘤、肺癌和肝癌高发，表明了自噬的抑癌作用。相反地，在结直肠癌、乳腺癌等肿瘤中，抑制自噬可以显著提高肿瘤最化疗的敏感性，此时自噬是促进肿瘤发展的。然而自噬是否参与肝母细胞瘤的发生发展并在其中发挥重要作用目前国内外未见相关报道。本实验首先观察自噬相关基因ATG5、BECN1在人肝母细胞瘤组织中的表达情况，然后在肝母细胞瘤细胞中通过饥饿和化疗两种方式去诱导自噬的发生，并检测自噬相关基因的变化，确定在肝母细胞瘤中的起主要作用的自噬相关基因，进一步通过自噬特异性抑制剂和siRNA干扰技术，明确自噬在肝母细胞瘤自然生长和化疗中的作用，最终在动物模型中去进一步验证自噬在肝母细胞瘤中的作用。实验方法1.通过电镜、Western blot、Real-time PCR、免疫组化等方法检测肝母细胞瘤中自噬活性及相关基因的表达；2.通过饥饿的方法诱导肝母细胞瘤细胞产生自噬，检测其中自噬相关基因的变化，并在饥饿同时加入自噬抑制剂，观察自噬在饥饿刺激中的作用；3.通过化疗药物刺激的方法诱导肝母细胞瘤细胞产生自噬，检测其中自噬相关基因的变化，并在化疗药物刺激同时加入自噬抑制剂，观察自噬在肝母细胞瘤化疗敏感性中的作用；4.通过siRNA干扰和自噬抑制剂确定肝母细胞瘤自噬相关基因和相关信号通路；5.裸鼠皮下荷瘤注射自噬抑制剂进一步明确自噬在肝母细胞瘤中的生物学功能。实验结果1.自噬在肝母细胞瘤中高度激活；2.自噬保护了肝母细胞瘤中饥饿诱导的自噬性凋亡；3.自噬保护了肝母细胞瘤中化疗诱导的自噬性凋亡，抑制自噬可以提高其化疗敏感性；4. BECN1/PI3K通路在肝母细胞瘤自噬中起关键作用；5.抑制自噬可以抑制肝母细胞瘤的生长。结论本研究发现自噬在肝母细胞瘤中被激活，并发现自噬在饥饿和化疗诱导的细胞凋亡中起保护作用，抑制自噬可以抑制肝母细胞瘤的生长，并提高其对化疗药物的敏感性。其中BECN1/PI3K通路起关键作用。本研究为深入理解自噬在肝母细胞瘤中的作用和机制提供新的线索，并为该病的治疗提供新的潜在靶点和策略。