老年性痴呆(Alzheimer disease，AD)是一种中枢神经系统退行性疾病，是引起老年人痴呆的最主要疾病，以记忆功能减退及认知功能障碍为典型临床表现。主要病理改变为患者脑内出现β-淀粉样蛋白形成的老年斑，神经元纤维缠结及神经元丢失。随着全球人口的老龄化，AD成为人类死亡的重要原因。近来的科学研究中，研究者发现Aβ及其前体在AD的发病机制中占据核心地位。为此，以Aβ为靶的AD治疗方法成为新的焦点。 1999年，Schenk等人在NATURE杂志上首次报道用人Aβ42对PDAPP转基因鼠进行主动免疫，并获得了成功。他们发现PDAPP转基因鼠体内产生了高滴度的抗Aβ抗体，并发现弥散性和致密性的Aβ沉积都明显降低，同样在Tg2576和TgCRND8转基因小鼠中，Aβ沉积明显减少，认知能力显著提高。在此基础上，Elan公司于2001年研制并开发出一种．AD疫苗-AN1792，Ⅰ期实验结果良好，但在Ⅱ期临床实验中，因为有6％的接种AD病人出现了无菌性脑膜脑炎，实验被迫终止。随后的尸检表明：患者脑组织中存在CD4+T细胞和巨噬细胞浸润。多数研究者认为Aβ42肽C末端的T细胞表位可能激发了Th1反应，从而诱发人体内T细胞的过度活化并导致炎症反应发生。于是研究者们认为：保留B细胞抗原表位，去除Aβ42T细胞抗原表位，避免Th1型反应，从而降低Aβ疫苗的毒性反应是减少AD疫苗不良反应的有效手段。 本课题组邹俊涛博士在前期实验中制备了重组4×Aβ15腺病毒(Ad-4×Aβ15)，它能分泌性共表达四价可折叠Aβ15及基因佐剂GM-CSF细胞因子，免疫Tg2576转基因鼠取得了良好的效果。本实验则是以不同剂量Ad-4×Aβ15接种于BALB/c鼠，寻求Ad-4×Aβ15疫苗的最佳免疫剂量并观察免疫效果，为疫苗的临床应用奠定基础。 材料和方法 1.重组Ad-4×Aβ15的扩增及鉴定 以低代重组Ad-4×Aβ15及Ad-GMCSF反复感染293细胞(lipofectamine2000)，获得大量重组腺病毒颗粒。氯化铯密度梯度离心纯化腺病毒Ad-4×xAβ15及Ad-GMCSF。Western blotting法检测感染细胞上清中4×Aβ15的表达。ELISA法测定GM-CSF的含量。 2.不同剂量重组Ad-4×Aβ15接种BALB/c鼠的体液免疫效应 6-8周雄性BALB/c小鼠，按照剂量随机分组为：109pfu组、108pfu组、107pfu组以及Ad-GMCSF(109pfu)，每组6只，经鼻黏膜途径免疫，3周免疫1次，20μ1/R，第1次免疫后两周首次鼠尾采血，以后每3周采血1次，采血量约100μ1/只，共接种6次。停止免疫后，每3周采血1次，持续采血3次。观察抗体低度维持情况，取血清置于-70℃备用。 间接ELISA法检测血清中抗体的滴度的变化情况。Western blot法检测血清中抗体特异性。Tg2576鼠脑部切片老年斑免疫组化鉴定其特异性。 3不同剂量重组Ad-4×Aβ15疫苗接种BALB/c鼠安全性评价 观察记录疫苗接种后，BALB/c鼠的饮食、睡眠、精神、意识、活动；HE染色观察疫苗接种后BALB/c鼠的脑、肝和肾脏的形态结构；Perls法染色脑组织观察出血情况。 结果 1.重组Ad-4×Aβ15的扩增及鉴定 Western blot结果显示，4×Aβ15在感染的293细胞上清中表达，分子量约9×103。定量ELISA显示感染的HEK293A细胞上清GM-CSF含量为205.45±38.20ng/mL。氯化铯密度梯度低温超高速离心纯化得到的重组腺病毒Ad-4×Aβ15及Ad-GMCSF滴度分别为4.1x1010、1.8×1010pfu/mL。 2.不同剂量重组Ad-4×Aβ15疫苗接种BALB/c鼠的体液免疫效应观察 第2次接种后，小鼠体内开始检测到抗体。随着接种次数的增加，抗体滴度迅速升高。对照组抗体滴度一直处于背景水平。末次接种后，109pfu组、108pfu组和107pfu组的平均滴度分别是1：4625，1：4524，1：2260。停止免疫后，继续采血3次，抗体仍维持在较高水平。从第2测定抗体滴度(首次免疫后两周)开始，109pfu组和108pfu组两者平均抗体滴度差异无统计学意义(P>0.05)。从第3次滴度测定(第8周)开始，109pfu组及108pfu组与107pfu组的抗体滴度相比较，差异有统计学意义(P<0.05)。 Western blot实验表明，BALB/c小鼠血清中产生的抗体能与Aβ42特异性结合。疫苗接种后，BALB/c小鼠血清中的抗Aβ42抗体能与Tg2576转基因鼠脑组织内Aβ斑结合。 3.不同剂量重组Ad-4×Aβ15疫苗接种BALB/c鼠的安全性评价 实验期间，疫苗接种组BALB/c鼠外观正常；精神状况良好，食欲正常，意识清醒，运动正常。疫苗接种后，BALB/c的肝，脑、肾未见组织结构的病理改变，Perls染色成阴性，表明疫苗接种后未导致小鼠脑出血。 结论 1.成功扩增Ad-4×Aβ15，滴度为4.1x1011pfu/mL，能共表达4×Aβ15及GM-CSF。 2.不同剂量重组Ad-4×Aβ15疫苗接种BALB/c鼠均能产生特异性体液免疫应答。 3.从首次免疫开始，109pfu组和108pfu组两者抗体平均滴度差异无统计学意义(P>0.05)，但均与107pfu组差异有统计学意义(P<0.05)。从安全性上，108pfu为小鼠最合适免疫剂量。 4.3个剂量组各重要脏器均未出现病理损害，均未发生不良反应，安全性均良好。