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水母种类繁多，资源丰富，其具有的水螅世代(无性繁殖)和水母世代(有性繁殖)交替的特点造就其巨大的数量群体。水母具有强烈的生物毒性，其毒液主要由多种蛋白质、酶和多肽组成。由于水母毒素非常不稳定，极易失活，为后续的分离纯化研究带来了极大困难的同时也导致了水母毒素的鉴定、蜇伤的中毒机理以及防治策略研究进展的缓慢。近年来，随着组学研究技术的不断发展，构建水母转录组、蛋白组数据库并通过序列比对的方式筛选水母毒液中的毒素序列可以突破传统液相色谱活性检测需要大量活性样品、鉴定数量少的限制。与此同时，以构建多组学数据库及其联合分析为核心，结合形态学分析、保守序列筛选、毒性效应分析以及干预作用等系列研究，可以在水母相关新物种鉴定、主要毒性蛋白筛选以及毒性机理与干预策略等诸多方面都提供一个全新的研究思路，极大地促进了水母蜇伤防治相关研究水平的提升。本课题我们首先对主要分布于太平洋、大西洋北部和北冰洋，伞面上有一个硕大的特征性黑色星星图案的黑星海刺水母(Chrysaora melanaster)进行毒性评估、物种分子鉴定、组学分析与毒素蛋白筛选等系列研究。采用类似方法进一步对从南极海域采集的水母样未知物种进行了分子鉴定、组学分析与毒素蛋白筛选分析。
1、C.melanaster组织提取液(Tissue extract, TE)的生物毒性。体外研究表明TE(0~1.2mg/mL)可以呈剂量依赖性降解纤维蛋白原α链，且具有较强的溶血作用。采用麻醉状态的小鼠，静脉注射TE发现其半数致死剂量为4.96mg/kg。在高剂量7.2和12mg/kgi.v.下，注射TE后小鼠心率和血压出现不可逆地急剧下降并在15min内迅速死亡。在中剂量3.6mg/kgi.v.下，静脉注射TE后小鼠心率和血压在前5min内迅速下降，然后维持在注射TE前的40%和60%。低剂量1.2mg/kg对小鼠的心率和血压影响不大。因此，C.melanasterTE具有蛋白酶活性、溶血活性以及心血管毒性等水母毒液常见主要生物毒性。
2、成功构建C.melanaster总RNA转录组与miRNA数据库。转录组中共有66,254条unigene被成功拼接，其中23,965(36.17%)、16,823(25.39%)、7,833(11.82%)和5,459(8.24%)条unigene分别在NR、SwissProt、GO和KEGG数据库中被成功注释。在NR和SwissProt注释序列中，首先筛选出保守序列MT-CO1，通过形态分析和MT-CO1系统进化分析，确认所研究物种为C.melanaster。然后利用NR和SwissProt中的毒素数据库成功筛选出150个毒素相关mRNA，包括90种金属蛋白酶、14种磷脂酶、14种丝氨酸蛋白酶和32种其他毒素。将150个与毒素相关的mRNA分类为72种毒素，最后利用被识别的554条miRNA和72种毒素mRNA之间构建了一个由5,676个节点组成的复杂关系网络图，包括72种毒素靶点和5604条miRNA。其中与毒素Nas-13相关的mRNA结合301条miRNA最多，与毒素Dpy-31和SP-Hepsin相关的mRNA结合6条miRNA最少，平均每种毒素mRNA的结合miRNA的数量为78条。在554条miRNA中有550条对应到毒素，其中miRNAcme-undef-168靶向36种毒素mRNA最多，平均每条miRNA靶向毒素mRNA的种类为10种。研究结果表明miRNA可以互补地调节与毒素相关的mRNA。
3、借鉴于C.melanaster的研究方法，对在南极海域捕获的一种类似水母的未知物种DA-6进行了物种分子鉴定与组学分析。通过构建的转录组筛选出保守序列MT-CO1，随后进行形态分析和MT-CO1系统进化分析，DA-6被成功鉴定为一种南极樽海鞘(Antarctic Salpa sp.)。转录组成功拼接并获得47,183条unigene，用NR、SwissProt、GO和KEGG数据库分别成功地注释了11,954(25.34%)、10,006(22.21%)、4,469(9.47%)和4,901(9.71%)条unigene。以所构建的转录组为参考数据库，在蛋白质组分析中共获得4,680条多肽和1,280个蛋白，并在GO和KEGG数据库中都成功注释了549(31.98%)个蛋白。此外，还成功筛选出89条毒素相关unigene和5种毒素蛋白，89条unigene中包括金属蛋白酶、磷脂酶、丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、毒液磷酸二酯酶、过氧化物酶、毒液凝血酶原激活剂、C型凝集素和黄曲霉毒素等。其中，金属蛋白酶、磷脂酶、丝氨酸蛋白酶及其抑制剂是海洋有毒动物中常见的毒性组分。
本研究表明C.melanaster是一种具有酶活性、溶血性和心血管毒性的有毒水母。通过构建转录组筛选出毒素相关的mRNA，并进一步研究表明miRNA可能通过靶向于毒素相关mRNA而在水母毒素的表达调控中发挥了重要作用。这些mRNA和miRNA序列同时为C.melanaster的相关研究提供了一个公共数据库。此外，本研究还首次通过从头拼接转录组和蛋白质组联合分析的方法鉴定了物种DA-6为南极Salpasp.。并分析,筛选其潜在的毒素基因和蛋白，同样为进一步研究南极Salpasp.提供了一个公共的参考数数据库。
1、C.melanaster组织提取液(Tissue extract, TE)的生物毒性。体外研究表明TE(0~1.2mg/mL)可以呈剂量依赖性降解纤维蛋白原α链，且具有较强的溶血作用。采用麻醉状态的小鼠，静脉注射TE发现其半数致死剂量为4.96mg/kg。在高剂量7.2和12mg/kgi.v.下，注射TE后小鼠心率和血压出现不可逆地急剧下降并在15min内迅速死亡。在中剂量3.6mg/kgi.v.下，静脉注射TE后小鼠心率和血压在前5min内迅速下降，然后维持在注射TE前的40%和60%。低剂量1.2mg/kg对小鼠的心率和血压影响不大。因此，C.melanasterTE具有蛋白酶活性、溶血活性以及心血管毒性等水母毒液常见主要生物毒性。
2、成功构建C.melanaster总RNA转录组与miRNA数据库。转录组中共有66,254条unigene被成功拼接，其中23,965(36.17%)、16,823(25.39%)、7,833(11.82%)和5,459(8.24%)条unigene分别在NR、SwissProt、GO和KEGG数据库中被成功注释。在NR和SwissProt注释序列中，首先筛选出保守序列MT-CO1，通过形态分析和MT-CO1系统进化分析，确认所研究物种为C.melanaster。然后利用NR和SwissProt中的毒素数据库成功筛选出150个毒素相关mRNA，包括90种金属蛋白酶、14种磷脂酶、14种丝氨酸蛋白酶和32种其他毒素。将150个与毒素相关的mRNA分类为72种毒素，最后利用被识别的554条miRNA和72种毒素mRNA之间构建了一个由5,676个节点组成的复杂关系网络图，包括72种毒素靶点和5604条miRNA。其中与毒素Nas-13相关的mRNA结合301条miRNA最多，与毒素Dpy-31和SP-Hepsin相关的mRNA结合6条miRNA最少，平均每种毒素mRNA的结合miRNA的数量为78条。在554条miRNA中有550条对应到毒素，其中miRNAcme-undef-168靶向36种毒素mRNA最多，平均每条miRNA靶向毒素mRNA的种类为10种。研究结果表明miRNA可以互补地调节与毒素相关的mRNA。
3、借鉴于C.melanaster的研究方法，对在南极海域捕获的一种类似水母的未知物种DA-6进行了物种分子鉴定与组学分析。通过构建的转录组筛选出保守序列MT-CO1，随后进行形态分析和MT-CO1系统进化分析，DA-6被成功鉴定为一种南极樽海鞘(Antarctic Salpa sp.)。转录组成功拼接并获得47,183条unigene，用NR、SwissProt、GO和KEGG数据库分别成功地注释了11,954(25.34%)、10,006(22.21%)、4,469(9.47%)和4,901(9.71%)条unigene。以所构建的转录组为参考数据库，在蛋白质组分析中共获得4,680条多肽和1,280个蛋白，并在GO和KEGG数据库中都成功注释了549(31.98%)个蛋白。此外，还成功筛选出89条毒素相关unigene和5种毒素蛋白，89条unigene中包括金属蛋白酶、磷脂酶、丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、毒液磷酸二酯酶、过氧化物酶、毒液凝血酶原激活剂、C型凝集素和黄曲霉毒素等。其中，金属蛋白酶、磷脂酶、丝氨酸蛋白酶及其抑制剂是海洋有毒动物中常见的毒性组分。
本研究表明C.melanaster是一种具有酶活性、溶血性和心血管毒性的有毒水母。通过构建转录组筛选出毒素相关的mRNA，并进一步研究表明miRNA可能通过靶向于毒素相关mRNA而在水母毒素的表达调控中发挥了重要作用。这些mRNA和miRNA序列同时为C.melanaster的相关研究提供了一个公共数据库。此外，本研究还首次通过从头拼接转录组和蛋白质组联合分析的方法鉴定了物种DA-6为南极Salpasp.。并分析,筛选其潜在的毒素基因和蛋白，同样为进一步研究南极Salpasp.提供了一个公共的参考数数据库。