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目的:坏死性凋亡在脏器纤维化发生、发展中的作用逐渐引起研究者的重视,但其在糖尿病心肌纤维化中的作用及其机制尚缺少研究。本研究目的有:1.观察坏死性凋亡关键上游激酶受体相关蛋白激酶1、3(RIP1K、RIP3K)基因敲低及其抑制剂对高糖高脂培养的心脏成纤维细胞损伤和纤维化的影响,明确其作用机制与修复心脏成纤维细胞自噬流进程有关。2.研究 RIP1K 抑制剂 Nec-1、RIP3K 抑制剂 GSK872(GSK)对 RIP1K-RIP3K坏死小体的相互作用,探索低剂量Nec-1和GSK合用减少高糖高脂培养的心脏成纤维细胞损伤和纤维化的可行性。3.探讨Nec-1对T2DM大鼠体内心肌纤维化的作用及其与自噬流的联系。方法:体内实验选用SD雄性大鼠,通过高糖高脂饲养+链脲佐菌素腹腔注射法制备T2DM大鼠模型;体外实验选用原代乳鼠心脏成纤维细胞,传代后使用25 mM葡萄糖+500 μM棕榈酸盐的DMEM培养基培养48 h建立高糖高脂诱导的心脏成纤维细胞损伤模型。通过药理学方法(Nec-1、GSK)或基因敲低法(RIP1K knockdown、RIP3K knockdown)抑制体内、外RIP1K、RIP3K表达。采用ELISA法检测心脏成纤维细胞collagen Ⅰ、collagen Ⅲ含量、LDH漏出率、ATP含量,CCK-8检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡、坏死,观察RIP1K knockdown、RIP3K knockdown或Nec-1、GSK对高糖高脂培养的心脏成纤维细胞损伤和纤维化影响;采用Western blotting法检测LC3-Ⅱ、P62、及active-Cathepsin D蛋白表达,双荧光mRFP-GFP-LC3质粒转染及AO荧光染色法检测心脏成纤维细胞自噬流进程中自噬小体和溶酶体的改变,并使用自噬流阻断剂氯喹(chloroquine,CQ,10 μM)阻断自噬小体与溶酶体融合过程,明确RIP1K-RIP3K坏死小体与修复心脏成纤维细胞自噬流进程的联系。同时,合用低剂量 Nec-1(10 μM)、GSK(1 μM),采用 Western blotting 法、流式细胞仪、ELISA法检测Nec-1与GSK合用对高糖高脂培养的心脏成纤维细胞损伤和纤维化影响。另外,采用Masson染色测定心肌纤维化程度,超声心动图检测心功能,免疫组化法、Western blotting 法或 ELISA 法测定 RIP1K、RIP3K、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、α-SMA、LC3-Ⅱ、P62及active-Cathepsin D的表达和分布,探讨Nec-1对T2DM大鼠体内心肌纤维化的作用及其与自噬流的联系。结果:1.成功建立T2DM大鼠心脏模型和高糖高脂诱导的心脏成纤维细胞损伤模型。体内实验:糖尿病组(DM组)大鼠空腹血糖较对照组(CON组)明显升高;CON组和DM组大鼠体质量随时间逐渐增加,第16周龄起,DM组大鼠体质量与CON组比较有统计学意义。与CON组比较,DM组24周龄大鼠左室舒张末容积、左室收缩末容积减小,等容舒张时间延长,胰岛素水平无统计学意义,胰岛素敏感指标负值增高,心脏重量明显降低,心/体质量比、心肌间胶原纤维、胶原纤维面积比例、collagenⅠ、collagen Ⅲ含量均增加。体外实验:相比正常糖对照组(NG组,5 mM葡萄糖+20 mM甘露醇DMEM),高糖高脂组(HG组,25 mM葡萄糖+500 棕榈酸盐DMEM)培养48 h的心脏成纤维细胞collagen Ⅰ、collagen Ⅲ含量、α-SMA表达均增加,CCK-8结果提示细胞明显增殖。2.T2DM大鼠心脏模型和高糖高脂诱导的心脏成纤维细胞损伤模型中糖尿病组TNF-α水平升高,坏死性凋亡激酶关键蛋白RIPIK、RIP3K、p-RIPlK、p-RIP3K表达均增加。3.RIP1K、RIP3K基因敲低分别抑制心脏成纤维细胞RIP1K、RIP3K表达,并减少高糖高脂培养的心脏成纤维细胞LDH漏出,增加ATP含量,减少细胞凋亡和坏死、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ含量、α-SMA表达以及细胞增殖。4.RIPIK、RIP3K基因敲低减少高糖高脂培养的心脏成纤维细胞LC3-Ⅱ、P62、active-Cathepsin D 表达;mRFP-GFP-LC3 质粒转染及 AO 染色结果显示 RIP1K、RIP3K基因敲低改善高糖高脂培养的心脏成纤维细胞自噬流进程和增强溶酶体膜稳定性。5.RIP1K 抑制剂 Nec-1(100 μM)抑制 RIP1K 和 p-RIP1K 表达,RIP3K 抑制剂GSK(10 μM)抑制RIP3K和p-RIP3K表达,二者分别减少高糖高脂培养的心脏成纤维细胞LDH漏出,增加ATP含量,减少collagen Ⅰ、collagen Ⅲ含量、α-SMA表达,同时减少自噬和溶酶体标志蛋白表达,改善自噬流进程,增加溶酶体膜稳定性;自噬流抑制剂CQ消除Nec-1和GSK的上述作用。6.RIP1K敲低或Nec-1能亦抑制RIP3K和p-RIP3K水平,而RIP3K敲低或GSK亦能抑制RIP1K和p-RIPlK水平。低剂量Nec-1(10 μM)合用低剂量GSK(1 μM)明显抑制高糖高脂培养的心脏成纤维细胞RIP1K、RIP3K表达,显著减少LDH漏出,增加ATP含量,减少collagen Ⅰ、collagen Ⅲ含量、α-SMA表达,同时减少自噬和溶酶体标志蛋白LC3-Ⅱ、P62、active-Cathepsin D表达,改善自噬流进程,增加溶酶体膜稳定性。7.与DM组比较,Nec-1治疗组24周龄大鼠左室舒张末容积、左室收缩末容积增加,等容舒张时间缩短,胰岛素敏感指标负值、心/体质量比、心肌间胶原纤维、胶原纤维面积比例、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ含量、α-SMA表达均减少,同时减少自噬和溶酶体标志蛋白LC3-Ⅱ、P62、active-Cathepsin D表达。结论:RIP1K、RIP3K基因敲低或药理抑制其磷酸化可对RIP1K-RIP3K坏死小体产生相互作用,同时减轻高糖高脂诱导的心脏成纤维细胞损伤和纤维化,其机制可能与修复心脏成纤维细胞自噬流进程有关;低剂量Nec-1、GSK合用减少高糖高脂培养的心脏成纤维细胞损伤和纤维化,改善心脏成纤维细胞自噬流进程和增加溶酶体膜稳定性。Nec-1腹腔注射治疗改善T2DM大鼠心脏功能,减少心肌纤维化和自噬溶酶体蛋白表达。