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本课题基于本室与复旦大学生化与分子生物学实验室共同研制成功弓形虫P30乳酸球菌(Lactococcus lactis／P30)口服疫苗基础上的延伸工作，在研究的第一部分对弓形虫P30乳酸球菌口服疫苗的实际免疫效果进行考察，第二部分利用基因工程手段构建弓形虫ROP2-P30复合抗原。 目的：1．课题研究的第一部分观察弓形虫P30乳酸球菌口服疫苗(L．lactis／P30)的免疫效果。首先确定L．lactis／P30免疫小鼠产生免疫保护性的适宜剂量，在此剂量下考查L．lactis／P30口服免疫在小鼠体内诱导的体液免疫反应，以及产生的保护性效果，进一步分析L．lactis／P30口服免疫诱导小鼠产生的细胞免疫效果和抗体IgG的动态发生过程，最后观察L．lactis／P30口服免疫鼠血清中，细胞因子IFN-γ、IL-2及NO分子的变化情况。2．本研究课题的第二部分致力于弓形虫病复合型疫苗的研制，以进一步提高弓形虫P30乳酸球菌口服疫苗的免疫保护性效果。从弓形虫RH株总DNA中分别克隆棒状体蛋白ROP2和表面膜蛋白P30基因片段，联合克隆至表达载体pET28b中，构建重组质粒pET28b-ROP2-P30，导入大肠杆菌中表达，分析表达的重组蛋白ROP2-P30的免疫活性，为弓形虫病复合型疫苗的研制做准备。 方法：1．以3×10~9 CFU、3×10~8 CFU、3×10~7 CFU三种不同的免疫剂量，口服L．lactis／P30免疫BALB／c小鼠，设生理盐水组为阴性对照，4周内免疫7次，免疫结束后，各实验组分别收集小鼠血清，ELISA法检测生成的抗体lgG水平，同时用100个弓形虫强毒力RH株速殖子攻击各实验小鼠，通过比较免疫组与阴性对照组，在特异性抗体的生成量或免疫保护效率方面的差异确定适宜免疫剂量。根据确定的L．lactis／P30免疫剂量口服法免疫BALB／c小鼠，以gp42乳酸球菌组和生理盐水组为阴性对照，免疫结束后，各实验组分别收集小鼠血清，ELISA法检测生成的总抗体IgG和抗体亚类IgG1和IgG2a水平，同时用100个弓形虫强毒力RH株速殖子攻击各实验小鼠。取鼠脾细胞作ConA刺激淋转试验(MTT法)及T细胞亚群的测定，且从免疫一开始，每隔3周各实验组分别收集小鼠血清，ELISA法检测抗体水平的动态变化过程，ELISA法测定弓形虫P30乳酸球菌口服疫苗免疫效果研究及弓形虫ROPZ一P30基因工程复合抗原的构建摘要血清中细胞因子工FN一Y、工L一2的含量，酶法测定N0浓度。 2.采用CF一11纤维素柱分离提纯弓形虫速殖子，提取弓形虫总DNA。从基因组DNA中扩增编码弓形虫棒状体蛋白ROPZ基因片段，克隆至质粒pUCllg中，经PCR和酶切鉴定后，进行DNA序列测定，并以Sacl/Hindm双酶切克隆至表达载体pET22b上，重组质粒pET22b一ROPZ转化大肠杆菌BL21一Codon Plus(DE3)一RIL菌株中，经IPTG诱导表达。从基因组DNA中扩增编码弓形虫主要表面膜蛋白P30，克隆至己构建成功的重组质粒pUCllg一ROPZ中，组成重组质粒pUCllg一ROPZ一P30，并以Sael/Hindlll双酶切克隆至表达载体pET28b上，重组质粒pET28b一ROPZ一P30转化大肠杆菌RIL菌株，经工PTG诱导表达;IPTG诱导表达的产物超声破壁后，SDS一PAGE分析表达产物的表达形式，对产生的重组蛋白ROPZ一P30过S即hadexG一25交联葡聚糖柱，经尿素梯度洗脱进行目的蛋白的复性，通过免疫共沉淀反应及western一blot检测其复性后的重组抗原的免疫反应性。 结果:1.弓形虫乙.lactjs/P30通过口服三个不同的免疫剂量，在小鼠体内产生的抗体IgG并无显著差异，对抗虫体攻击，免疫剂量组1小鼠的平均存活时间有所延长，免疫剂量组2的小鼠最先出现死亡现象。L.la时z’s/P3O口服免疫小鼠组检测到了相应的抗体工gG，抗体亚类IgGZa的生成量稍高于IgGI，两对照组检测不到明显的相应抗体，攻击后，乙.1刁ctz’s/P30口服疫苗免疫组平均存活时间多于对照组4天。L.lactjs/P30口服免疫组脾淋巴细胞ConA刺激后增殖能力比两对照组显著提高，CD4+和CDS+的百分数均明显升高，第12周(即最后一次免疫结束一个月)，乙.lactjs/ P30口服免疫组检测到特异性抗体IgG。乙.lactjs/ P30口服免疫鼠血清中IFN一Y、IL一2含量均显著高于两对照组，血清中N0含量，随着免疫时间延长与两对照组差异逐渐明显。 2.从弓形虫RH株总DNA中扩增到ROPZ基因片段，构建成功重组质粒pUCllg一ROPZ，经DNA序列分析与己报道序列基本一致，重组质粒pET22b一ROPZ在大肠杆菌中表达产生一分子量约为45kDa的重组蛋白。从总DNA扩增到P3O基因片段，构建成功重组质粒pucllg一ROPZ一P30，重组表达质粒pET28b一ROPZ一P3O在大肠杆菌中表达产生一分子量约为69kDa的重组蛋白，免疫印迹分析证实能够被弓形虫感染者血清特异性IgG所识别二该重组蛋白为与载体弓形虫P3O乳酸球菌口服疫苗免疫效果研究及弓形虫ROPZ-P30基因工程复合抗原的构建摘要pET28b上的8个组氨酸序列(HIStidine tag)高效表达的融合蛋白，融合表达产物以包涵体形式存在，包涵体经离心、洗涤后，蛋白得到纯化，蛋白量未有损失。重组蛋白经复性处理后，通过免疫共沉淀反应及Western一blot检测，该重组蛋白ROPZ一P30能够与弓形虫感染病人阳性血清结合。 结论:1.(1)确定了3xlo，CFU的免疫剂量，?