微生物细胞的有机溶剂耐受性在生物催化和转化,生物能源生产及环境污染治理等应用中至关重要。因此,深入研究微生物细胞的有机溶剂耐受机制,对于提高微生物菌株有机溶剂耐受性及其在工业领域的应用具有重要的意义。大肠杆菌因其遗传背景清楚,基因操作简单,是一种重要的模式菌株。本研究基于基因芯片分析,对丁醇胁迫条件下携带了σ70突变体B8的丁醇耐受大肠杆菌E.coli JM109/pHACMB8和对照菌株E.coli JM109/pHACMWT的转录组进行了比较。结果表明:共有329个差异表达基因(差异倍数均在2倍以上,p-value<0.05),其中197个基因转录水平上调,132个基因转录水平下调。通过同源序列聚类分组(COG)数据库,对差异基因的分布特点及基因的功能进行分析。发现与丁醇耐受密切相关的基因主要有以下几类功能:能量产生与转换,信号转导,翻译、核糖体结构与生成,氨基酸运输与代谢,以及细胞运动等。通过KEGG数据库对差异基因的具体代谢路径进行分析,发现这些基因主要参与乙醛酸和二羧酸代谢,丙酮酸代谢,氨基酸代谢和溶剂外排泵等。基于以上芯片结果分析,分别采用基因过表达和基因敲除的方法对15个上调基因和14个下调基因的功能进行研究。结果显示:上调基因glcF、gcl、yhaR、ybbQ和tdcE的过表达有助于提高大肠杆菌的丁醇耐受性;而将下调基因yibT、yghW和ybjC敲除后,牛津杯平板中菌落形成数量与对照菌株相比在数量级上也分别提高了102,102和101倍。为了进一步探究关键基因的耐受机制,本研究对敲除菌株△yibT和△ygh W的细胞膜脂肪酸组成和细胞表面疏水性进行了测定。与对照菌株相比,敲除菌株的C16:1,C18:1等不饱和脂肪酸含量增加了20%~30%,细胞表面疏水性升高。同时,采用GFP融合蛋白的方法,鉴定了ybjC基因编码的膜蛋白。通过对ybjC过表达菌株的胞内丁醇含量测定,发现其胞内丁醇含量比对照菌株高25%。此外,通过构建glc基因簇中几个基因的过表达和共表达菌株,发现glcA基因过表达后,菌株无法生长;只有当共表达整个glc基因簇时菌株才能恢复正常生长。最后,本研究对glcF、glcG和gcl过表达菌株发酵液中的有机酸含量进行了测定,发现gcl和glcF过表达菌株的丙酮酸浓度分别是对照菌株的4.66倍和1.63倍,丁醇刺激会进一步提高发酵液中丙酮酸的含量。通过以上分析得出以下结论:(1)敲除菌株△yibT和△yghW丁醇耐受性的提高与细胞膜脂肪酸组分变化有关。(2)ybjC基因编码膜蛋白可能参与溶剂的转运。(3)glcA基因受glc基因簇中其他基因的调控。(4)glcF和gcl基因的过表达有助于丙酮酸含量的增加,丁醇刺激会进一步提高丙酮酸的含量,这可能对细胞产能发挥重要作用。本研究对大肠杆菌中溶剂耐受性相关基因的作用机制进行了初步探究,为基因工程改造微生物提高其溶剂耐受性提供了理论依据。