基于分支杂交链式反应的双模式适配体传感器的构建及在ATP检测中的应用

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目的:三磷酸腺苷作为一种不稳定的高能化合物,是体内的直接能量来源,在许多生物过程中发挥着至关重要的作用。本研究结合量子点和分支杂交链式反应构建了基于荧光和电感耦合等离子体质谱(Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry,ICP-MS)检测的ATP双模式适配体传感器,获得了良好的灵敏度和检测限。使用构建的传感器对CRC患者血液中的ATP含量进行定量检测,并与正常人血液进行对比。方法:首先将含有适配体的寡链核苷酸序列所修饰的伯氨基与活化后的羧基磁珠(Carboxy Magnetic Beads,MBs)进行酰胺化偶联,使用紫外分光光度计下测量260nm下的RNA含量。随后将经过高温变性后形成发夹结构的修饰有生物素的四条序列在合适的离子浓度下加入到磁珠适配体溶液中,进行分支杂交链式反应(branched Hybridization Chain Reaction,b HCR)后形成MBs-b HCR复合物,使用琼脂糖凝胶电泳进行表征。最后,链酶亲和素标记的量子点(Quantum Dots-Streptavidin,QDs-SA)作为荧光和元素探针,通过生物素-链酶亲和素之间的特异反应结合在该复合物上,形成最终的MBs-b HCR-QDs生物传感器。使用透射电镜和荧光显微镜分别对传感器和QDs-SA进行表征。为了得到最适的实验条件,对实验中的各个条件进行了优化,首先对Ta序列的碱基臂长以及H2序列进行了优化,然后通过对MBs-Ta结构、b HCR反应序列最适比例、b HCR反应时间和温度、QDs的影响因素、ATP反应时间以及ICP-MS的消解条件进行优化。随后,在最适的实验条件下,加入不同浓度的ATP检验该传感器的分析性能,并与仅引入直链HCR的情况进行了对比。同时对类似ATP的小分子进行特异性实验分析了该传感器的特异性,并在复杂基质样本中加入ATP标准品以分析该传感器的抗干扰能力。最后收集结直肠腺癌患者的组织和外周血样本,进行ATP含量的检测,并与正常人外周血进行对比。结果:根据透射电镜和荧光显微镜结果得出MBs-b HCR-QDs生物传感器已经构建,对实验的条件进行优化得出,最优序列为H2;Ta序列加入的最适浓度为7.2nmol·L-1以及Poly T臂长最佳为10个T碱基;MBs与Ta酰胺化反应的最佳时间为8h;b HCR中Ta:H1:H2:H3:H4的最适浓度比例为2:5:5:10,杂交反应的最适时间为2h,最适温度为37°C;加入QDs的最佳浓度为5nmol·L-1,最佳时间为1h;ATP反应的最佳时间为2h,ICP-MS最适的消解溶液为1mol·L-1的HNO3溶液消解30分钟。对该传感器的分析性能研究表明,采用b HCR作为信号扩增时,ATP浓度在0.01 nmol·L-1-1.5 nmol·L-1范围时,荧光检测获得的线性关系为y=1227*x+226.9,检测限为8.89 pmol·L-1;ICP-MS检测获得的线性关系为y=3433996*x+127151,检测限为0.026 pmol·L-1。而使用一维直链HCR作为信号扩增,当ATP浓度在10 nmol·L-1-200 nmol·L-1时,荧光检测获得的线性关系为y=4.278*x+191.9,检测限为2.549 nmol·L-1;ICP-MS检测获得的线性关系为y=12409*x+325063,检测限为0.0072 nmol·L-1。在特异性验证时,可见加入ATP后荧光信号的增强与另外三种溶液及空白溶液有明显差别,并在真实血清样本中ATP回收率分布在95-106%之间。最后将CRC患者的外周血进行ATP的检测,并与正常人外周血进行对比,得出肿瘤患者ATP含量显著高于正常。结论:本研究基于适配体与ATP特异性结合后会引发构象的改变,加入磁珠结合含适配体的DNA序列进行吸附分离,通过分支杂交链式反应进行信号扩大以完成对信号的指数扩增,最后通过生物素-链酶亲和素反应将作为荧光和元素标记探针的量子点与扩增后获得的DNA多聚体结合,结合荧光和ICP-MS检测两者相互印证,成功构建了无需酶类参与,反应简单快速,高灵敏度高特异性的基于b HCR和QDs标记的荧光及ICP-MS双模式ATP检测系统。
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