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食管癌是一种常见的恶性肿瘤。我国平均每年发病人数约250,000人，约占全世界年均发病人数的50%以上。目前普遍认可的是，食管癌的发生是多因素、多基因、多阶段的复杂的发生发展过程。但其确切的发病机制尚未完全阐明。因此，食管癌治疗的主要研究方向依然是其发生发展过程中细胞内信号传导通路的异常活化和新型抗肿瘤药物的靶点。多个研究报道证明：mTOR/4EBP1信号转导通路在肿瘤发生发展中存在异常的激活。mTOR通路被认为是蛋白质合成的主要信号调节通路，参与细胞增殖、分化、迁移等调节。mTOR是一种多功能激酶，参与许多重要细胞功能的调节。活化的mTOR使其下游的4EBP1发生磷酸化，磷酸化的4EBP1与eIF4E的亲和力下降并与之解离，促进翻译起始复合物形成，从而加速蛋白质合成。与之相反，当mTOR被抑制时，使得4EBP1发生去磷酸化，并与eIF4E结合从而抑制翻译过程起始并诱导细胞凋亡。本实验通过转染wtmTOR质粒来研究食管癌细胞中4EBP1表达及活化的改变，探讨wtmTOR质粒对人食管癌细胞中mTOR信号通路的影响，并进一步检测Bufalin（蟾蜍灵）对mTOR/4EBP1通路及细胞凋亡的影响。从而揭示食管癌的发生、发展机制，并为食管癌的治疗提供新的思路。目的：探讨Bufalin对人食管癌细胞4EBP1活化及凋亡的影响。方法：1将携带wtmTOR基因的质粒转化至DH5α大肠杆菌中进行扩增，并使用脂质体法将携带wtmTOR基因的质粒成功转染到食管癌Eca109细胞中，使用Western Blot方法分别检测转染质粒0h、12h、24h、30h、36h、42h、48h后细胞内4EBP1表达及其活化水平的变化，并得出转染的最佳时间。2用Western Blot方法分别检测不同处理组（对照组、空载体转染组、wtmTOR质粒转染组、转染后加Bufalin组、转染后加雷帕霉素组）中细胞内mTOR的表达，并检测4EBP1表达及活化水平，进而研究转染wtmTOR质粒后Bufalin对食管癌mTOR通路的影响。3用RT-PCR方法分别检测不同处理组（对照组、空载体转染组、wtmTOR质粒转染组、转染后加Bufalin组、转染后加雷帕霉素组）中细胞内mTOR分子水平的表达。并检测不同处理组细胞内4EBP1分子水平的表达。4采用免疫细胞化学方法检测不同处理组（对照组、空载体转染组、wtmTOR质粒转染组、转染后加Bufalin组、转染后加雷帕霉素组）细胞内Bad和Bcl-2蛋白表达的变化。结果：1RT-PCR结果显示：成功将wtmTOR质粒扩增并转染到食管癌细胞中，并检测到Eca109细胞株内mTOR的mRNA水平表达量在wtmTOR质粒转染组（1.274±0.006）明显高于对照组（0.422±0.012）及空载体转染组（0.450±0.025）；而在转染后加入Bufalin（0.304±0.026）及雷帕霉素（0.244±0.015）后又明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。而4EBP1的mRNA水平表达量在对照组（1.015±0.021）、空载体转染组（1.004±0.016）、wtmTOR质粒转染组（1.085±0.017）、转染后加Bufalin组（1.077±0.024）、转染后加雷帕霉素组（1.046±0.020）之间无明显区别，差异不具有统计学意义（P>0.05）。2成功将wtmTOR质粒扩增并转染到食管癌细胞中，并检测到其下游基因4EBP1表达水平在转染0h、12h、24h、30h、36h、42h、48h后无明显变化（0.872±0.021，0.854±0.016，0.796±0.011，0.787±0.015，0.831±0.034，0.835±0.032，0.788±0.036，P＞0.05），差异不具有统计学意义。而4EBP1的活化水平在wtmTOR质粒转染后明显升高，且随转染后时间的增加（0h、12h、24h、30h）表达量逐渐升高（0.357±0.025，0.572±0.022，0.655±0.017，0.895±0.021），至30h（0.895±0.021）达到最高值，此后（36h、42h、48h）表达量开始下降（0.641±0.014，0.425±0.031，0.352±0.034，P＜0.05），差异具有统计学意义。3Western Blot结果显示：成功将wtmTOR质粒扩增并转染到食管癌细胞中，并检测到mTOR的表达水平在转染组（0.967±0.015）明显高于对照组（0.472±0.033）和空载体转染组（0.495±0.028）；而在转染后加入Bufalin（0.398±0.031）及雷帕霉素（0.381±0.024）后表达水平明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。4EBP1蛋白的表达水平在对照组（0.655±0.013）、空载体转染组（0.642±0.026）、wtmTOR质粒转染组（0.670±0.015）、转染后加Bufalin组（0.674±0.023）、转染后加雷帕霉素组（0.645±0.033）无明显差别，差异不具有统计学意义（P>0.05）。4EBP1的活化水平在转染组（0.825±0.016）明显高于对照组（0.502±0.031）和空载体组（0.521±0.027）；而在转染后加入Bufalin（0.376±0.015）及雷帕霉素（0.352±0.022）后活化水平明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。4免疫细胞化学法结果显示：Bcl-2和Bad蛋白主要表达于食管癌细胞Eca109的细胞浆或细胞膜，为棕黄色，在高倍镜下观察呈颗粒状，结果显示转染wtmTOR质粒组Bad阳性表达率为16.53%，明显低于对照组（35.67%）和空载体组（37.81%）；而在转染后加入Bufalin（64.22%）及雷帕霉素（65.30%）后又明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。而转染wtmTOR质粒组Bcl-2阳性表达率为86.67%，明显高于对照组（64.43%）和空载体组（62.75）；而在转染后加入Bufalin（37.26%）及雷帕霉素（36.07%）后又明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：1Bufalin可通过抑制mTOR/4EBP1的活化来抑制食管癌Eca109细胞株的生长。2Bufalin可通过抑制Bcl-2、促进Bad蛋白的表达进而促进人食管癌Eca109细胞株的凋亡。