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褪黑素(Melatonin,MLT)是一种广泛存在于生物有机体各组织器官的多功能内源性激素,对动物生殖细胞及胚胎发育有重要影响。但是,关于MLT对猪卵母细胞及胚胎发育的作用及机制了解较少。本研究旨在探讨外源MLT对猪卵母细胞体外成熟(In Vitro Maturation,IVM)和孤雌胚胎体外发育的影响,为优化猪卵母细胞和胚胎培养基、深入研究MLT的作用机制奠定基础。具体研究内容及结果如下:试验一不同浓度MLT(对照组:0nM;试验组:1nM、10nM、100nM)对猪卵母细胞IVM的影响。通过核成熟率、成熟卵H3K27ac与H4K16ac水平、MII期卵母细胞孤雌后胚胎发育率及胚胎质量等指标评价MLT的影响。结果表明,与对照组相比,试验组均能显著提高猪卵母细胞核成熟率(P<0.05),且1nM处理组明显促进了囊胚形成(P<0.05)。1nM处理组来源的MII期卵母细胞H3K27ac和H4K16ac均显著下降(P<0.05)。试验二不同时间段添加1nM MLT对猪卵母细胞IVM的影响。结果显示,IVM前半程(0-22h)、全程(0-42h)处理组的卵母细胞极体排出率及孤雌胚胎囊胚率均显著高于对照组(P<0.05),而IVM后半程(22-42h)处理组无显著性提高(P>0.05);不同处理组与对照组相比在卵裂率和囊胚总细胞数上均未见明显变化(P>0.05)。试验三1nM MLT对来源于中卵泡(卵泡直径为4-7mm)、小卵泡(卵泡直径1-3mm)的猪卵母细胞IVM的影响。结果表明,1nM处理显著提高了小卵泡来源的卵母细胞极体排出率(P<0.05),但对孤雌后胚胎发育无明显影响(P>0.05);对中卵泡来源的卵母细胞极体排出率、孤雌后囊胚率和囊胚总细胞数上均有显著性提高(P<0.05),但对卵裂率无影响(P>0.05)。试验四1nM MLT对卵丘颗粒细胞包裹层次少(颗粒细胞包裹≤1层)的卵母细胞以及人工裸卵IVM的影响。结果显示,无论是颗粒细胞包裹≤1层的卵母细胞还是人工裸卵成熟,1nM处理均能促进其成熟卵孤雌胚胎的囊胚形成(P<0.05),而对极体排出率、卵裂率和囊胚总细胞数均无显著改善(P>0.05)。试验五不同浓度MLT(对照组:0nM;试验组:1nM、10nM、100nM)对猪孤雌胚胎体外发育的影响。结果发现,与对照组相比,处理组均可显著提高囊胚率(P<0.05),其中10nM处理组优于1nM和100nM处理组;在囊胚总细胞数上,10nM处理组显著优于对照(P<0.05),而1nM和100nM处理组无显著提高(P>0.05)。试验六胚胎体外培养(IVC)不同时间段添加10nM MLT对猪孤雌胚体外发育的影响。结果显示,与对照组相比,前半程(0-72h)和全程(0-168h)添加10nM MLT明显提高猪孤雌胚囊率(P<0.05),而后半程(72-168h)添加无明显变化(P>0.05);不同处理组对卵裂率和囊胚总细胞数均无显著影响(P>0.05)。试验七将猪卵母细胞IVM和孤雌胚胎IVC阶段筛选出的MLT优选浓度进行组合添加对猪孤雌胚胎发育的影响。分组为对照组(0nM+0nM),处理组1(0nM+10nM),处理组2(1nM+0nM),处理组3(1nM+10nM)。结果表明,在囊胚率方面,处理组均显著升高(P<0.05);囊胚总细胞数方面,处理组3明显增多(P<0.05),其它处理组无显著差异(P>0.05)。试验八MLT对卵母细胞凋亡、自噬以及卵丘扩散相关基因表达的影响。在IVM阶段,分别收集对照组和1nM MLT处理组成熟的卵母细胞及卵丘细胞,采用荧光定量PCR技术检测了卵丘扩散相关基因EFNB2、HAS2、PTX3及卵母细胞成熟AKT2、BMP15、GDF9、p34等相关相关基因的相对表达量。结果发现,在卵丘颗粒细胞中,MLT处理显著促进卵丘颗粒细胞扩散相关基因EFNB2、HAS2、PTX3的表达(P<0.05);在MII期卵母细胞中,AKT2、BMP15、GDF9、p34相对表达水平显著上升(P<0.05)。总之,本研究发现:在猪卵母细胞IVM和孤雌胚IVC阶段,添加1nM和10nM MLT有利于卵母细胞核成熟、胞质成熟及孤雌囊胚发育,且均是在IVC前半程培养阶段发挥积极作用;MLT(1nM)可促进猪卵母细胞成熟及孤雌后胚胎发育,该作用与组蛋白修饰及自噬、氧化应激、卵丘细胞扩散、细胞凋亡基因的表达密切相关。该研究结果为进一步揭示褪黑素影响猪卵母细胞体外成熟及植入前胚胎发育的机制奠定了基础。