背景:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染是HCC的主要原因。宿主免疫系统无法有效地清除肝细胞内HBV,使肝组织长期处于非可控性炎症状态,不断出现以“炎症-坏死-增生”为特征的肝脏病变过程。在此过程中,HBV通过改变自身CD8+T细胞识别表位实现免疫逃逸,病毒变异经过不彻底的免疫选择,逐渐选择出能够逃避免疫识别和攻击的变异型HBV,这种变异HBV可以促进HCC的发生发展。HBV突变的主要特征之一是CD8+T细胞表位缺失,其中A1762T/G1764A变异在HCC发生之前10年被就可以被选择出来,是炎症免疫环境对HBV变异的选择。HLA-DR是机体抗病毒免疫反应中的重要分子,HBV感染后与HLA-DR结合,向CD4+T细胞呈递抗原肽表位通过免疫细胞受体促进CD4+T细胞活化,随后促进B细胞分化产生病毒特异性抗体,并且分泌细胞因子促进CD8+T细胞和NK细胞杀伤HBV。T细胞受体(T cell receptor,TCR)和B细胞受体(B cell receptor,BCR)是适应性免疫应答中的重要分子,HBV刺激可影响TCR和BCR多样性的形成。研究HBV感染人群淋巴细胞中TCR或BCR免疫组库在HBV致癌不同阶段(ASCs、CHB、LC和HCC)中的动态变化有助于更好地理解HBV感染过程中免疫微环境。因此研究HLA-DR参与HBV变异免疫选择和致癌过程中的作用以及TCR和BCR在HBV感染后致癌过程中的动态变化,阐明HBV变异免疫选择机制,有利于确定何种HBV感染者将发展成HCC,为HCC特异性预防奠定基础。目的:研究HLA-DR单核甘酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与HBV感染慢性化和致HCC的相关性及HLA-DR SNP与致癌HBV突变在HCC发生中的交互作用;阐明免疫组库在HBV致癌不同阶段中的动态变化特征。方法:采用Taq Man-MGB探针定量PCR法检测1240例健康对照者、300例HBV自然清除者、311例无症状HBs Ag携带者(asymptomatic HBs Ag carriers,ASCs)、936例慢性乙肝(chronic hepatitis B,CHB)患者、611例肝硬化(liver cirrhosis,LC)患者以及1190例HCC患者HLA-DRA基因多态性位点(rs3135395、rs3135338、rs2395178)和HLA-DRB1基因多态性位点rs477515的基因型分型。利用巢式PCR法对HBV Enh II/BCP/PC和pre S区序列进行扩增。采用Logistic回归模型分析HLA-DRSNP和疾病之间关系以及SNP位点与突变的相乘性交互作用对HCC发生的影响。采用Cox比例风险回归模型分析HCC患者术后生存的影响因素。采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验比较SNP位点不同基因型HCC患者的生存率。利用双荧光素酶报告基因检测SNP对HLA-DR基因增强子区功能的影响。应用免疫组库测序对有/无A1762T/G1764A双突变的ASCs、CHB、LC和HCC患者淋巴细胞受体TCR和BCR进行检测,比较不同阶段V基因和J基因使用率及克隆多样性等指标。结果:1、分析HLA-DR SNP和HBV慢性感染及HBV自然清除关系,发现以HBV自然清除者为对照,rs3135395 GT基因型和显性模型(GT+TT)、rs3135338 TC基因型和显性模型(TC+CC)、rs477515 TT基因型和显性模型(CT+TT)可显著降低发生HBV慢性感染的风险(rs3135395 GT:AOR(95%CI)=0.63(0.48-0.84),P=0.001,GT+TT:AOR(95%CI)=0.67(0.51-0.88),P=0.004;rs3135338 TC:AOR(95%CI)=0.66(0.50-0.87),P=0.004,TC+CC:AOR(95%CI)=0.73(0.56-0.95),P=0.021;rs477515 TT:AOR(95%CI)=0.67(0.49-0.91),P=0.011,CT+TT:AOR(95%CI)=0.70(0.52-0.93),P=0.014)。2、分析HLA-DR SNP和HCC发生风险的关系,发现以非HCC HBV感染者为对照,rs3135395 TT基因型、rs3135338 CC基因型、rs2395178 CG基因型和显性模型(CG+GG)、rs477515 TT基因型可降低HBV感染者发生HCC的风险(rs3135395 TT:AOR(95%CI)=0.68(0.46-0.96),P=0.031;rs3135338 CC:AOR(95%CI)=0.67(0.47-0.96),P=0.030;rs2395178 CG:AOR(95%CI)=0.80(0.68-0.95),P=0.011,CG+GG:AOR(95%CI)=0.80(0.69-0.94),P=0.006;rs477515 TT:AOR(95%CI)=0.78(0.64-0.97),P=0.024)。3、分析HLA-DR SNP和HBV突变在HCC发生中的交互作用,发现在基因型C感染者中rs3135395 GT基因型与A1762T/G1764A、C1653T、G1719T、T1753C在HCC发生中存在显著的协同性交互作用(A1762T/G1764A:AOR(95%CI)=1.945(1.365-2.773),P=2.32×10-4;C1653T:AOR(95%CI)=1.983(1.161-3.388),P=0.012;G1719T:AOR(95%CI)=1.421(1.021-1.972),P=0.035;T1753C:AOR(95%CI)=2.079(1.190-3.632),P=0.010)。rs3135338 TC基因型与A1762T/G1764A、T1753C在HCC发生中存在显著的协同性交互作用(A1762T/G1764A:AOR(95%CI)=1.920(1.330-2.773),P=4.93×10-4;T1753C:AOR(95%CI)=1.842(1.141-2.974),P=0.012)。4、Cox多因素回归分析显示HBe Ag阳性(HR(95%CI)=2.944(1.725-5.024),P<0.001)、肿瘤大小≥5cm(HR(95%CI)=2.848(1.715-4.731),P<0.001)、微血管浸润(HR(95%CI)=3.696(2.217-6.160),P<0.001)是HCC患者术后生存的独立危险因素,而术后抗病毒治疗(HR(95%CI)=0.233(0.137-0.397),P<0.001)和rs477515低频基因型(HR(95%CI)=0.565(0.425-0.751),P<0.001)则是HCC患者术后生存的独立保护因素。AFP≥20 ng/m L(HR(95%CI)=1.552(1.005-2.397),P=0.048)、肿瘤大小≥5cm(HR(95%CI)=1.643(1.062-2.543),P=0.026)、微血管浸润(HR(95%CI)=2.973(1.941-4.553),P<0.001)是HCC患者术后复发的独立危险因素,而术后抗病毒治疗(HR(95%CI)=0.473(0.298-0.752),P=0.002)和rs477515低频基因型(HR(95%CI)=0.611(0.401-0.932),P=0.022)则是HCC患者术后复发的独立保护因素。5、Hep G2和LO2细胞中含rs3135338-C和rs3135338-T的增强子区片段转录活性无显著差异(Hep G2细胞:P=0.543;LO2细胞:P=0.066)。Hep G2细胞中含有rs477515-T的HLA-DRB1增强子片段转录活性显著高于含rs477515-C的增强子片段(8.2倍,P=5.0×10-6);且LO2细胞中含有rs477515-T的HLA-DRB1增强子片段的转录活性显著高于含rs477515-C的增强子区片段(6.4倍,P=2.9×10-5)。Hep G2细胞中在IFN-γ刺激下含有rs477515-T的HLA-DRB1增强子活性显著增加(t=11.360,P=3.0×10-4);在IL-6刺激下含有rs477515-C和rs477515-T的HLA-DRB增强子片段转录活性均显著降低(rs477515-C:t=6.134,P=0.004;rs477515-T:t=4.429,P=0.011);在IL-4刺激下含有rs477515-C的HLA-DRB1增强子片段活性显著增加(t=5.734,P=0.005)。LO2细胞IFN-γ刺激下含有rs477515-T的HLA-DRB1增强子活性显著增加(t=4.785,P=0.009);在IL-6刺激下含有rs477515-T的HLA-DRB增强子片段转录活性显著降低(t=3.835,P=0.019);在IL-4刺激下含有rs477515-C和rs477515-T的HLA-DRB1增强子片段活性均无显著变化(P>0.05)。6、TCR免疫组库测序显示TRBV5-1、TRBV20-1、TRBV29-1、TRBV12-3、TRBV28以及TRBJ2-7、TRBJ2-1、TRBJ2-3、TRBJ2-5、TRBJ1-1是各组样本共同使用的高频Vβ和Jβ基因片段。ASCs、CHB和LC野生组与突变组之间CDR3数目的差异无统计学意义(P均>0.05),而HCC野生组CDR3数目显著高于HCC突变组(P=0.006),不同疾病状态ASCs、CHB、LC和HCC野生组与突变组之间的Shannon Wiener系数、Simpson系数和inverse Simpson系数的差异无统计学意义(P均>0.05)。7、BCR免疫组库测序显示IGHV3-23、IGHV4-39、IGHV3-21、IGHV3-30、IGHV1-18和IGHJ4是各组样本共同使用的高频Vβ和Jβ基因片段。CHB野生组CDR3数目显著高于CHB突变组(P=0.014),同样HCC野生组CDR3数目显著高于HCC突变组(P=0.004),而ASCs和LC野生组与突变组之间CDR3数目的差异无统计学意义(P均>0.05)。ASCs、CHB和LC野生组与突变组之间的Shannon Wiener系数的差异无统计学意义(P均>0.05),而HCC野生组的Shannon Wiener系数显著高于HCC突变组(P=0.018)。不同疾病状态ASCs、CHB、LC和HCC野生组与突变组之间的Simpson系数和inverse Simpson系数的差异无统计学意义(P均>0.05)。结论:1、rs3135395 GT基因型、rs3135338 TC基因型和rs477515 TT基因型可降低HBV感染慢性化。rs3135395 TT基因型、rs3135338 CC基因型、rs2395178 CG基因型和rs477515 TT基因型可降低HCC的发生风险。2、rs3135395、rs3135338、rs2395178和rs477515低频基因型和致癌HBV突变C1653T、T1753V和A1762T/G1764A在HCC发生中存在显著的交互作用。3、rs477515-T可通过提高增强子活性从而促进HLA-DRB1的转录。4、表达TRBV5-1/J2-1、TRBV5-1/J2-7、TRBV20-1/J2-7、TRBV20-1/J2-7和TRBV5-1/J2-3基因片段的T细胞以及表达IGHV3-23、IGHV4-39、IGHV3-21、IGHV3-30、IGHV1-18基因片段的B细胞构成了HBV感染后宿主适应性免疫应答的基本成分。5、与ASCs、LC和HCC患者相比,CHB患者TCR和BCR克隆多样性更为明显。