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研究背景:肺癌死亡率居常见恶性肿瘤的首位,放疗是局部晚期肺癌综合治疗的主要方法之一,但由于放疗过程中亚致死性和潜在致死性损伤修复所导致的放疗抵抗在很大程度上降低了肺癌放射治疗的敏感性,因此人们试图通过针对DNA损伤修复的靶向治疗来抑制肿瘤细胞的损伤性修复。Nm23-H1作为肿瘤转移抑制基因,除具有核苷二磷酸激酶(NDPK)、组氨酸/丝氨酸激酶外,还具有3’-5’核酸外切酶活性。因此当前研究认为Nm23-H1还可能参与DNA损伤修复。我们前期研究及文献报道证实,Nm23-H1与DNA损伤修复中的碱基切除修复及核苷酸切除修复有关。我们同时还发现Nm23-H1在电离辐射(Ionizing Radiation IR)诱导下发生核转位,而电离辐射主要诱导DNA双链断裂(DSBs),因此其很有可能还参与了DSBs损伤修复,而这一机制目前还未见报道。研究目的:本研究拟采用肺癌A549细胞为研究对象,抑制或核过表达A549细胞的Nm23-H1蛋白,探讨Nm23-H1在电离辐射诱导肺癌细胞DNA双链断裂中的作用及其机制研究。研究内容和方法:1.本研究首先构建Nm23-H1可诱导表达载体和带有核引导序列的Nm23-H1过表达载体并稳定转染肺癌A549细胞系;采用Western blot验证Nm23-H1蛋白的表达,免疫荧光实验检测核过表达细胞株的Nm23-H1蛋白亚细胞定位;并通过CCK-8实验检测Nm23-H1核过表达A549细胞株的细胞增殖情况。2.检测Nm23-H1在电离辐射诱导肺癌细胞DNA双链断裂中的作用:采用单细胞凝胶电泳实验检测8Gy X线电离辐射后1h、2h、4h时DNA双链断裂损伤修复的情况;通过激光共聚焦检测γ-H2AX foci实验来观察8Gy X线电离辐射后DNA双链断裂损伤修复的情况。3.Nm23-H1在电离辐射诱导肺癌细胞DNA双链断裂中的作用机制:通过Western blot检测8Gy X线电离辐射后ATM是否激活,并检测其下游分子通路的磷酸化水平变化;通过免疫共沉淀实验检测8Gy X线电离辐射Nm23-H1与DNA损伤修复相关蛋白结合情况。研究结果:1.Nm23-H1可诱导稳定敲低和Nm23-H1核过表达A549细胞株的成功构建:shNm23-H1可调控重组载体质粒pLentis-Bid-tetO-H1-NM23-SFFV-GTP酶切鉴定及测序结果测序均验证正确,Western blot验证该稳定转染细胞系构建成功;Nm23-H1(NME1)核内定位表达载体pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO酶切鉴定及测序结果测序均验证正确,Western blot验证未转染组的A549细胞Nm23-H1蛋白的定位及表达主要在胞浆,而转染组的Nm23-H1蛋白在胞浆和胞核均检测到,且主要以胞核表达为主。免疫荧光实验显示未转染组Nm23-H1蛋白主要位于A549细胞的胞浆,转染后其在细胞核表达明显增多,证明稳定转染细胞系构建成功。采用CCK-8法检测Nm23-H1核过表达组细胞的增殖,结果显示空载体组与空白对照组相比,二者无明显差异,Nm23-H1核过表达组增殖速度快于对照组和空载体组,与空载体组相比在72h、96 h和120 h差异有统计学意义。2.Nm23-H1在电离辐射诱导肺癌细胞DNA双链断裂中的作用研究:(1)单细胞凝胶电泳实验结果显示,A549细胞经8Gy X线照射后,Nm23-H1敲低组与对照组相比,敲低组可以显著增加彗尾DNA含量,提示Nm23-H1可能参与DNA双链断裂损伤的修复;Nm23-H1核过表达组结果显示其在1h、2h、4h较对照组彗星尾矩显著减少,且具有显著性差异(P<0.05),同样提示Nm23-H1参与DNA双链损伤的修复。(2)激光共聚焦检测γ-H2AX foci结果显示,A549细胞经8Gy X线照射后,Nm23-H1敲低组随着时间的延长γ-H2AX foci阳性细胞数消散速度较对照组慢,在8h时二者具有显著差异性差异(P<0.05),Nm23-H1核过表达组的γ-H2AX foci阳性细胞数在2hr后消散较对照组更快(P<0.05),而且该结果较敲低组更为明显,提示Nm23-H1参与了电离辐射导致的DSBs损伤修复,而这一作用可能与Nm23-H1的核转位有关。3.Nm23-H1在电离辐射诱导肺癌细胞DNA双链断裂中的作用机制研究:(1)通过Western blot检测8Gy X线电离辐射后ATM是否激活,并检测其下游分子通路的磷酸化水平变化,结果显示Nm23-H1核过表达细胞组在8Gy X线照射后能使pS1981-ATM、pS15-p53、pT68-Chk2表达均增强,而Nm23-H1敲低组则使以上三种磷酸化蛋白少表达甚至不表达。说明Nm23-H1可以通过对ATM、p53、Chk2磷酸化的激活参与DSBs损伤修复。(2)通过免疫共沉淀实验,检测8Gy X线电离辐射Nm23-H1与DNA损伤修复相关蛋白结合情况,结果显示8Gy X线照射1hr后,在Nm23-H1的免疫沉淀复合物中检测到NBS1、RAD50、MRE11、Ku80蛋白,尤其是NBS1和Ku80蛋白在Nm23-H1核核过表达组结合更为明显;而当肺癌细胞未受电离辐射时,则未在Nm23-H1的免疫沉淀复合物中检测到上述蛋白。说明Nm23-H1亦可通过与DNA损伤修复相关蛋白的结合来参与DSBs的修复。结论:1.Nm23-H1可诱导敲低A549细胞株和我们首次构建的Nm23-H1核内定向表达株的建立,为进一步探讨Nm23-H1参与DSBs的修复奠定了实验基础,同时研究发现Nm23-H1核过表达对A549细胞起促进细胞增殖的作用。2.单细胞凝胶电泳实验和γ-H2AX foci检测实验结果均证实Nm23-H1参与了电离辐射诱导A549肺癌细胞的DNA双链断裂损伤修复作用。3.Nm23-H1可能通过两种机制参与DSBs损伤修复,一是通过磷酸化激活ATM-Chk2-p53通路参与DSBs损伤修复;一是通过与DNA损伤修复蛋白结合,尤其与NBS1和Ku80的结合参与DSBs损伤修复。