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利用人胰岛素原基因组DNA与山羊乳蛋白调控序列、增强子序列以及新霉素抗性基因共同组成乳腺特异性表达载体，将此构件转染山羊乳腺上皮细胞，经激素诱导获得了表达重组人胰岛素的山羊乳腺上皮细胞系，从而为制备乳腺特异性表达转基因山羊奠定了基础。
一、乳腺特异性表达载体的构建
人胰岛素原基因组DNA，以人的全血基因组DNA为模板经高保真PCR扩增获得，长度为1.2Kb，包含信号肽序列、A、B、C肽链序列DNA；β-乳球蛋白(BLG)基因调控序列，以萨能奶山羊基因组为模板经高保真长PCR扩增获得，其中5端长度为4.2Kb，3端长度为1.8Kb；增强子序列为600bp左右，富含细胞转录因子结合位点DNA序列以及NEOr新霉素抗性基因。通过以上元件，成功构建了奶山羊β-乳球蛋白调控序列及增强子序列共同指导人胰岛素原基因乳腺特异性表达载体BIC13。
二、山羊乳腺上皮细胞系的建立与药物筛选
采用胶原酶和透明质酸酶消化法从处于泌乳状态的萨能奶山羊的乳腺组织中分离得到原代乳腺上皮细胞，将乳腺特异性表达载体片段BLG5-Enhancer-hPI-NEOr-BLG3(9.7Kb)电转染入第四代奶山羊乳腺上皮细胞，经含400μg/mlG418的筛选培养液筛选三周后，得到10个有抗性的细胞株。提取细胞基因组，经PCR扩增表明，其中有6个细胞株成功转染了外源基因。
三、阳性乳腺上皮细胞系的诱导表达与检测
对转染有外源基因的细胞株进行扩大培养，同时用催乳素诱导表达，48小时后提取上清进行胰岛素ELASA检测，6个细胞株均能表达重组人胰岛素/胰岛素原，其中MIC2和MIC3两个单细胞克隆株表达量分别达78μIU/ml和52.7μIU/ml，而未转染乳腺上皮细胞株(MEC1)表达量仅为10.9μIU/ml，差异极显著。
四、结论
本研究所构建的人胰岛素原乳腺特异性表达构件，可在体外培养的山羊原代乳腺上皮细胞中表达人胰岛素原。