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乙酰异戊酰泰乐菌素(AIV)是一种高效的大环内酯类抗生素,有着很高的工业应用价值。它是通过耐热链霉菌生物转化泰乐菌素,在泰乐菌素的3-OH乙酰基化和4″-OH异戊酰基化而获得。本研究希望通过在耐热链霉菌中分别整合acyB1-B2基因、ermE基因和中断nsdA基因三个方面的分子改造,以提高泰乐菌素转化率。本研究首先通过摇瓶装量、转种量、种龄、发酵培养周期4个摇瓶发酵参数的研究,初步确定了耐热链霉菌摇瓶发酵的最佳工艺流程。出发菌株经二级种子培养24 h后,以10%的转种量,转种到35 mL发酵培养基,48 h后补加泰乐菌素和亮氨酸,补料48 h测转化率,出发菌株泰乐菌素转化率稳定在70%。AcyA负责乙酰基化功能,acyB1-B2负责异戊酰基化功能,acyB2基因是acyB1基因的正调控基因。本研究将acyB1-B2基因单独克隆出來,插入pIJ8600构建成整合表达载体pBIB425,导入耐热链霉菌工业菌株BIB0830中,得到重组菌株BIB425。HPLC分析表明,与出发菌株BIB0830相比,BIB425泰乐菌素转化率提高了14%。结果表明单独增加acyB1基因拷贝数不足以提高耐热链霉菌的异戊酰基化酶活,acyB2基因的激活作用在整个酰基化过程中至关重要。ErmE基因类似于carB基因,编码核糖体双甲基化酶。本研究以pIJ8600为出发菌株,构建了ermE(ermEp~*)基因的整合表达载体pBIB304。通过属间接合转移,整合到BIB0830中,抗性筛选和PCR验证得到阳性克隆BIB304。结果表明重组菌株BIB304在固体平皿和液体YEME培养基中对泰乐菌素的耐受性均从100μg/mL提高到900μg/mL。在摇瓶水平上,导入红霉素的抗性基因对耐热链霉菌生物量和转化泰乐菌素无明显影响。本研究还对在链霉菌中普遍存在的负调控基因nsdA进行了研究。通过接合转移nsdA基因中断载体pBIB308,得到nsdA基因中断突变株BIB308。HPLC结果显示:在摇瓶水平上,BIB308的泰乐菌素转化率提高了22%。