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内皮细胞的结构和功能完整是维持血管内环境稳定的关键因素。正常状态下,内皮细胞通过释放舒张和收缩因子参与调节血管对机械张力和神经递质的反应性,在血管功能的调节过程中发挥了重要作用。临床研究表明,内皮功能不全是高血压、动脉粥样硬化、高血脂等心血管疾病发病早期的标志性变化,其中活性氧(reactive oxidative species,ROS)生成增多是导致内皮功能不全的主要原因。血管紧张素II(AngiotensinⅡ,Ang II)是肾素血管紧张素系统(resin-angiotensin system,RAS)中的重要生物活性肽,在调节血管功能和结构中发挥重要作用。Ang II通过激活NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)提高血管细胞的ROS水平,从而影响Rho A/Rho激酶、转录因子、络氨酸激酶等下游信号通路,最终调节血管细胞的增殖、炎症和衰老。ClC-3氯通道属于电压依赖性氯通道家族,普遍存在于哺乳动物细胞中可作为容积调节性氯通道或Cl-/H+交换体参与调节细胞的PH、容积、增殖、分化、迁移、凋亡等生理病理活动。最近有报道称在肺微血管内皮细胞中Ang II诱导的O2-依赖于ClC-3氯通道跨越细胞膜从而介导细胞内信号;ClC-3 si RNA或给以氯通道抑制剂DIDS可抑制细胞外O2-的内流。另有研究发现,在ClC-3缺陷的平滑肌细胞,TNF-α和IL-1β诱导的超氧阴离子生成被显著抑制。此外ClC-3缺陷小鼠中性粒细胞的NOX活性较正常细胞明显降低,同时其跨内皮转运及游走、吞噬功能也在不同程度上下降。我们实验室前期研究发现在高血压发病过程中ClC-3容积调节性氯通道的活性增强。而且,ClC-3基因敲除后可通过抑制NADPH氧化酶活性从而降低ROS水平,最终抑制Ang II诱导的内皮祖细胞凋亡。以上结果表明ClC-3氯通道可在多种细胞类型参与ROS生成的调节从而影响细胞功能。然而,ClC-3是通过何种机制调节NADPH氧化酶/ROS生成的还不清楚。考虑到ROS形成增多导致的内皮功能不全在心血管疾病形成过程中的重要作用,本课题主要探讨ClC-3对内皮细胞中NADPH氧化酶和ROS生成的影响及机制。第一部分ClC-3对AngⅡ诱导的内皮细胞氧化应激的影响分别建立Ang II诱导内皮细胞氧化应激损伤体外模型和高血压在体模型,应用腺病毒转染、免疫荧光、SA-β-半乳糖苷酶染色等方法,探讨ClC-3在Ang II诱导内皮细胞氧化应激损伤中的作用,结果发现:1.在体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC),沉默ClC-3不影响基础状态下O2-生成,但可抑制Ang II诱导的O2-生成。相反过表达ClC-3则提高基础状态和Ang II刺激后O2-的水平(n=6,**P<0.01 vs.CON,##P<0.01 vs.Ang II+CON)。2.沉默ClC-3后不影响基础状态NADPH氧化酶活性,但对Ang II刺激下NADPH氧化酶活性的升高有显著性抑制作用。而过表达ClC-3则对基础状态和Ang II刺激下NADPH氧化酶活性有明显促进作用(n=4,*P<0.05 vs.CON,#P<0.05 vs.Ang II)。3.进一步在野生型(WT)和ClC-3敲除(KO)的小鼠建立Ang II诱导的高血压模型,提取主动脉切片检测氧化应激水平。结果发现,WT-Con与KO-Con的主动脉ROS含量没有差异,Ang II明显增加了WT小鼠的主动脉ROS水平,但在Ang II处理的ClC-3 KO的小鼠,主动脉ROS含量显著低于WT小鼠,并与KO-Con没有差异(n=3,**P<0.01 vs.WT-Con,##P<0.01 vs.WT-Ang II)。4.为了进一步探讨ClC-3调控氧化应激在内皮损伤中的作用,我们采用SA-β-半乳糖苷酶染色法检测了Ang II诱导的内皮细胞衰老。给予Ang II后,HUVEC的SA-β-半乳糖苷酶活性明显升高,提示细胞衰老。沉默ClC-3不影响基础状态SA-β-半乳糖苷酶活性,但对Ang II刺激下SA-β-半乳糖苷酶活性有显著性抑制作用。而过表达ClC-3则对基础状态和Ang II刺激下SA-β-半乳糖苷酶活性均有明显促进作用。小结:1.ClC-3促进Angiotensin II诱导的内皮细胞NADPH氧化酶活性和氧化应激水平升高。提高NADPH氧化酶活性是ClC-3促进血管内皮细胞氧化应激的重要机制。2.在高血压小鼠模型中,ClC-3敲除可抑制Angiotensin II诱导主动脉ROS生成增多3.敲除ClC-3可抑制,而过表达ClC-3则促进Ang II诱导的血管内皮细胞衰老。第二部分ClC-3影响NADPH氧化酶活性的机制研究本部分在Ang II诱导内皮细胞氧化应激损伤体外模型采用免疫印迹、免疫共沉淀等方法,探讨ClC-3氯通道基因对Ang II诱导内皮细胞NADPH氧化酶活性增强的作用机制,结果表明:1.Ang II增加HUVEC中p22phox和NOX2的蛋白表达,但是对p47phox、p67phox、Rac1的蛋白表达没有影响。下调ClC-3不影响基础状态下p22phox和NOX2的蛋白表达,但可抑制Ang II诱导的p22phox和NOX2的蛋白表达增加;上调ClC-3可提高基础状态和Ang II刺激下p22phox和NOX2的蛋白表达(n=5,*P<0.05 vs.CON,#P<0.05 vs.Ang II)。然而ClC-3对p47phox、p67phox、Rac1的蛋白表达没有影响。2.免疫共沉淀的结果显示,在内皮细胞中ClC-3与p22phox、p47phox、p67phox、Rac1有直接的相互作用,但是与NOX2没有直接相互作用。3.Ang II促进p22phox/p47phox和p67phox/p47phox的蛋白间相互结合(p<0.05,n=6)。沉默ClC-3可取消Ang II对p22phox/p47phox和p67phox/p47phox蛋白间相互结合的促进效应,另外,当过表达ClC-3时,则进一步促进了Ang II诱导的p22phox/p47phox和p67phox/p47phox蛋白间相互结合(n=4,*P<0.05vs.CON,#P<0.05 vs.Ang II)。4.Ang II不影响p67phox与p47phox的总蛋白表达(见结果1),但促进p67phox与p47phox在细胞膜的表达,提示他们由胞浆向细胞膜的转运增加。沉默ClC-3不影响基础状态下p67phox与p47phox在细胞膜上的表达,但可抑制Ang II诱导的p67phox、p47phox由胞浆向细胞膜转运的作用,另外过表达ClC-3对基础状态和Ang II刺激下细胞膜中p67phox、p47phox的表达均有显著促进作用(n=5,*P<0.05 vs.CON,#P<0.05 vs.Ang II)。5.Ang II促进p47phox的磷酸化,沉默ClC-3不影响基础状态下p47phox磷酸化水平,但对Ang II诱导p47phox磷酸化有抑制作用,另外过表达ClC-3在基础状态和Ang II刺激下对p47phox的磷酸化均有促进作用(n=4,*P<0.05 vs.CON,#P<0.05 vs.Ang II)。6.Ang II促进p38的磷酸化,沉默ClC-3不影响基础状态下p38磷酸化水平,但可抑制Ang II诱导的p38磷酸化,另外当过表达ClC-3对基础状态和Ang II刺激下p38磷酸化均有显著促进作用(n=3,*P<0.05 vs.CON,#P<0.05 vs.Ang II)。7.p38MAPK抑制剂SB203580(10μM)可以抑制过表达ClC-3对p47phox磷酸化的促进作用(n=6,**P<0.01 vs.Ang II,##P<0.01 vs.Ang II+Ad-Cl C 3)。小结:1.上调ClC-3可促进NADPH氧化酶胞膜亚基p22phox和NOX2的蛋白表达,及胞浆亚基p67phox与p47phox的结合和向胞膜转运。干扰ClC-3则抑制上述过程。2.上调ClC-3表达可促进p47phox和p38-MAPK的磷酸化,干扰ClC-3后可以抑制Ang II诱导的p47phox和p38-MAPK的磷酸化。3.ClC-3通过p38-MAPK通路促进p47phox磷酸化,从而激活NADPH氧化酶复合物的组装。结论1.ClC-3促进Angiotensin II诱导的内皮细胞NADPH氧化酶活性和氧化应激水平升高。2.ClC-3通过促进NADPH氧化酶胞膜亚基p22phox和NOX2的蛋白表达,及胞浆亚基p67phox与p47phox向胞膜的转运增加NADPH氧化酶复合物的生成从而提高NADPH氧化酶活性。3.ClC-3通过p38-MAPK通路促进p47phox磷酸化,从而增加NADPH氧化酶亚基p67phox与p47phox之间的相互结合和胞膜转运激活NADPH氧化酶复合物的组装。