1背景及目的胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,2012年WHO统计数据表明全球每年胃癌新发病例超过95万例,每年因胃癌死亡的人数超过72万人,病死率占恶性肿瘤的第三位。2015年我国癌症登记中心资料显示,胃癌发病率与死亡率逐年升高,仅次于肺癌,严重危害人类的健康和生命。近年来,随着胃癌治疗的迅速发展,方案逐渐完善,早期胃癌的5年死亡率显著下降,而晚期胃癌的的5年死亡率仍高达30%-50%。另外对于胃癌早期的诊断,仍处于较低水平。目前随着人们对于胃癌分子水平深入的研究,认为胃癌的发生是遗传和环境因素综合作用的结果,是一个通过多途径、多阶段、多基因共同参与的一个过程。研究发现,易感基因的多态与胃癌易感性存在显著的相关性,目前认为易感基因变化可通过某些功能或通路导致这部分人群较其他人更容易导致胃癌发生,如氧化损伤、炎症反应、DNA损伤修复、黏膜保护以及细胞增殖能力等方面。由于缺乏方便敏感的早期检测生物标志物及有效的治疗手段,导致胃癌更轻易的出现进展、转移、最终死亡。因此,寻找胃癌早期诊断、治疗及预后相关的新的潜在生物标志物成为研究热点。在过去的几年里,精准医疗已经深刻地改变了一些恶性肿瘤的治疗前景。医疗精准化促使全球癌症治疗的显著改善,并使“一刀切”的时代成为历史。然而,与大多数类型癌症存活率稳步上升相比,胃癌的进展缓慢且困难。事实上,尽管有一些显著的创新,但仍然迫切需要对这种癌症的遗传和分子背景有更深入的了解,并寻求新的治疗方法。生物信息学是一门交叉学科,涉及多个领域,高通量技术是其核心内容之一,利用其严谨复杂的算法,研究具有表达调控的内在机制,揭示人类疾病的本质规律,尤其是在肿瘤中作用尤为重要,为更准确、全面、快速的诊断和有效治疗疾病创造条件。癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)是一个于2005年启动的项目,利用基因组测序和生物信息学构建广泛癌症的基因组变化图谱。TCGA数据库包含33种癌症类型,超过10,000病人样本。TCGA数据库中包含了大量的肿瘤基因信息以及相应的临床资料,对于从分子水平进一步分析及挖掘肿瘤发生发展的相关机制而言是一个丰富的资源。本研究包括以下两部分:本研究第一部分通过WGCNA(Weighted correlation network analysis,加权相关网络分析)方法分析及构建胃癌显著表达基因的模块,并结合疾病的临床特征资料,探索模块基因网络与关注的表型之间的相关性,并进一步分析识别出模块网络中最为关键的5个枢纽基因,可做为胃癌治疗的潜在靶标。第二部分则是综合WGCNA分析结果及RNA差异分析结果,并基于生物信息学的方法,构建ceRNA调控网络,进一步分析ceRNA潜在的生物功能,探索胃癌特异性ceRNA网络中各RNAs在胃癌中可能的相关机制。2方法及结果2.1 WGCNA分析探讨模块网络采用WGCNA方法结合胃癌相关临床特征资料分析及构建胃癌显著表达基因模块,并探索模块基因网络与关注的表型之间的相关性,识别模块网络中的枢纽基因。WGCNA分析结果得到14模块,模块-特征相关结果显示其中8个模块 red、megenta、yellow、brown、cyan、pink、salmon、blue 与 pathologic_T(肿瘤T分期)存在相关性,其中red模块(cor=0.31,p=6e-09)最为相关。通过对red模块中的基因功能分析结果表明,模块基因主要富集的通路及功能与肿瘤、免疫等相关。通过设定的GS(基因显著性)>0.2且MM(模块身份)>0.85阈值,选取red模块中的枢纽基因,结果共筛选出22枢纽基因,其中HAVCR2,CYBB,LAIR1,SLAMF8以及CD86为前5个MM值最高基因。这5个基因主要与肿瘤免疫活动相关,可能通过介导胃癌的免疫反应,参与胃癌发展过程,并为胃癌的治疗提供了潜在的分子靶标。2.2 ceRNA调控网络的构建基于差异基因和WGCNA分析结果,利用生物信息学方法,通过miRcode数据库以及miRNA靶基因预测数据库miRDB,TargetScan和miRTarBase成功构建胃癌特异性lncRNA相关的ceRNA调控网络,其中包括6个lncRNA、10个miRNA以及44个靶mRNA。并分析ceRNA潜在的生物学功能,结果表明,ceRNA主要参与肿瘤相关通路,介导胃癌的发生发展。另外,通过对ceRNA中的 RNAs 生存分析结果表明,lncRNAs PVT1;miRNA mir-137,mir-145,mir-96以及靶mRNA ANGPT2等与胃癌患者预后密切相关,为胃癌的治疗和预后提供新的潜在的分子靶标。最后,通过构建蛋白互作网络,根据节点度/degree,共筛选网络中15最为关键基因,可能与胃癌的发生密切相关。3结论1、基于生物信息学方法,构建胃癌显著表达基因的模块网络及ceRNA调控网络,为胃癌发病机制的研究提供了一定的理论基础。2、WGCNA分析结果共获得8个与胃癌病理T分期存在相关性的模块,其中与病理T分期最相关的red模块中的基因主要参与了细胞粘附分子,肿瘤坏死因子通路,细胞凋亡通路,PI3K-Akt通路,抗原加工提呈通路及免疫反应、免疫应答等功能,认为red模块中的基因可能通过调控机体或肿瘤的的免疫活动从而影响胃癌的T分期,参与胃癌发生发展过程。3、进一步通过设定基因显著性(GS)和模块身份(MM)阈值,从red模块中成功筛选5个最为重要的枢纽基因HAVCR2,CYBB,LAIR1,SLAMF8,CD86,这5个基因主要与肿瘤免疫活动相关,可能通过介导胃癌的免疫反应,参与胃癌发展过程,并为胃癌的治疗提供了潜在的分子靶标。4、本研究基于WGCNA分析结果,综合生物信息学方法,成功构建了胃癌特异性ceRNA调控网络,其中包含6个lncRNA、10个miRNA、44个靶mRNA,为胃癌ceRNA实验室研究提供一定的理论基础和方向。5、lncRNAPVT1,miR-96,miR-137,miR-145,ANGPT2,SERPINE1,CHEK1,CDC25A不仅包含于ceRNA网络中,且与胃癌患者的预后相关。研究报道其与多种肿瘤的发病机制密切相关,由此我们认为这些8个关键RNAs可能通过ceRNA调控网络,在胃癌中发挥重要的作用,可作为胃癌潜在的治疗新靶点及检测预后的分子靶标。