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目的:S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase associated protein 2,Skp2）在泛素化降解修饰中起到识别底物的功能,通过降解细胞周期蛋白而调控肿瘤的发生和进展。近年来,Skp2被认为在多种肿瘤中发挥关键的调控作用,但Skp2在骨肉瘤中的作用目前尚不明确。本文拟通过转染Skp2 cDNA表达质粒或小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）改变骨肉瘤中Skp2的表达,探讨Skp2对骨肉瘤生长、转移等恶性生物学行为的影响及其可能的分子机制。由于Skp2还与肿瘤耐药密切相关,本文将使用甲氨蝶呤（methotrexate,MTX）持续诱导的方法建立骨肉瘤耐药细胞株,检测MTX耐药细胞生物学特性;并进一步用Skp2短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）感染耐药细胞,获得稳定下调Skp2的耐药细胞株,检测Skp2对细胞耐药的影响及其分子机制。方法:第一部分:利用转染的方法向骨肉瘤细胞株MG63和U2OS导入Skp2的过表达质粒以上调细胞内Skp2的表达,实验分组分别为对照组（没有经过任何处理）、control cDNA组（转染空载体组）、Skp2 cDNA（转染Skp2的过表达质粒）,按照上述分组分别处理细胞,分别进行以下操作:1)qRT-PCR和western blotting检测细胞内Skp2的mRNA和蛋白表达水平;2)MTT方法检测细胞生长情况;3)Annexin V/PI双染后流式细胞仪检测细胞凋亡情况;4)PI单染流式细胞仪检测细胞周期改变;5)Transwell迁移和侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭情况;6)Western blotting方法检测细胞内P21、P57、E-caderin、MMP等蛋白水平的改变;第二部分:利用RNAi的方法下调骨肉瘤细胞株MG63和SW1353细胞Skp2表达。1)合成3条Skp2的干扰序列,分别为siRNA1、siRNA2和siRNA3,分别向细胞内转染3条Skp2干扰序列和非特异的干扰序列NC.si RNA,qRT-PCR和western blotting检测细胞内Skp2的mRNA和蛋白表达水平,根据筛选结果,选择一条下调效率最高的siRNA用于后续实验;实验分组分别为对照组（没有经过任何处理）、NC.siRNA组（转染非特异的干扰序列）、siRNA组（转染skp2的si RNA序列）,按照上述分组分别处理细胞;2)MTT方法检测细胞生长情况;3)Annexin V/PI双染后流式细胞仪检测细胞凋亡情况;4)PI单染流式细胞仪检测细胞周期改变;5)创伤愈合实验和transwell实验检测细胞的迁移和侵袭情况;6)Western blotting检测细胞内Skp2的下游基因P27、p57、Foxo1、E-cadherin、pAkt的表达变化;第三部分:利用甲氨蝶呤持续诱导的方法建立甲氨蝶呤耐药的骨肉瘤细胞株（MTX resistance cell lines,MR）:1)MTT的方法检测MR细胞的耐药情况;2)与亲本细胞相比,显微镜下观察MR形态的变化;3)与亲本细胞相比,qRT-PCR和western blotting方法检测MR细胞的上皮-间质细胞转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）表征蛋白改变;4)qRT-PCR和western blotting方法检测MR细胞和亲本细胞相比Skp2表达的改变;5)创伤愈合实验和transwell侵袭实验分别检测亲本细胞和耐药细胞的迁移和侵袭能力改变;6)利用cell attachment assay和cell detachment assay检测细胞的粘附能力和脱落能力;7)利用Skp2 siRNA下调MR细胞中Skp2的表达,western blotting验证其下调效率;8)显微镜下观察Skp2下调前后MR细胞形态的改变;9)创伤愈合实验和transwell侵袭实验分别检测Skp2下调前后MR细胞的迁移和侵袭能力改变;10)cell attachment assay和cell detachment assay检测Skp2下调前后MR细胞的粘附能力改变;11)MTT方法检测Skp2下调前后MR细胞对甲氨蝶呤的敏感性改变;12)qRT-PCR和western blotting方法检测Skp2下调前后MR细胞EMT表征蛋白的改变结果:第一部分:1)qRT-PCR和western blotting结果显示,Skp2 cDNA组的Skp2的表达水平明显高于对照组和转染空载体组（P<0.05）;2)MTT结果显示,上调Skp2表达后,细胞的生长能力明显增强（P<0.05）;3)Annexin V/PI双染结果显示,上调Skp2表达后,细胞凋亡能力明显减弱;4)PI单染实验结果显示,Skp2上调后,S期细胞数明显增加,细胞阻滞于S期;5)Transwell迁移和侵袭实验结果显示,细胞内过表达Skp2后,可以明显促进细胞的迁移和侵袭能力;6)WB实验结果显示,Skp2上调后,Skp2下游靶分子E-caderin、Foxo1、P21、P57的表达明显下调,而MMP-9的表达则明显上调。第二部分:1)qRT-PCR和western blotting的实验结果显示,Skp2 siRNA2的下调效果优于其他2条siRNA序列,后续实验将选用siRNA2作为实验组;2)MTT结果显示,与对照组和NC.siRNA组相比,Skp2 siRNA组细胞增殖明显受到抑制（P<0.05）;3)凋亡结果显示,Skp2下调后骨肉瘤细胞的凋亡率明显增加;4)细胞周期结果显示,与其他2组相比,Skp2 siRNA组G0/G1期细胞数明显增加,提示Skp2下调后,细胞生长被阻滞在G0/G1期;5)创伤愈合实验和transwell迁移实验结果显示,Skp2下调后明显抑制了细胞的迁移能力,transwell侵袭实验结果显示,Skp2下调对细胞的侵袭能力具有明显的抑制作用;6)Western blotting的结果显示,Skp2siRNA组P27、p57、Foxo1、E-cadherin的表达升高,但PAKT的表达明显减弱（P<0.01）。第三部分:1)MTT结果显示,20μM及以上浓度的MTX处理细胞后,骨肉瘤亲本细胞生长明显受到抑制,而MR细胞表现出对MTX的耐受;2)显微镜下观察MR细胞与亲本细胞相比,细胞形态变细变长,类似于成纤维细胞形态（间充质细胞）;3)我们检测了细胞EMT表征蛋白的mRNA和蛋白表达水平,结果显示,MR细胞与亲本细胞相比,EMT表征蛋白的表达发生变化,其中E-caderin、ZO-1的表达下降,而其他几种表征蛋白如Slug、N-caderin、Vimentin等的表达升高,结合细胞形态的变化,提示耐药细胞发生了EMT的改变;4)为了进一步探讨Skp2在MR细胞中的作用,我们检测了MR细胞和亲本细胞中Skp2的表达,结果显示,不论是mRNA水平还是蛋白水平,Skp2的表达在MR细胞中都高于亲本细胞;5)细胞迁移和侵袭实验证明,MR细胞的迁移和侵袭能力均高于亲本细胞;6)细胞脱落和粘附实验证实,MR细胞的脱落和粘附能力要高于亲本细胞;7)WB实验结果证实Skp2 shRNA慢病毒颗粒侵染MR细胞对Skp2的稳定下调作用;8)显微镜下观察发现Skp2下调后,MR细胞变圆,由间叶细胞向上皮样细胞形态转化;9)分别检测Skp2下调前后,MR细胞的迁移和侵袭作用,结果显示下调Skp2可以抑制MR细胞的迁移和侵袭作用;10)同样的,Skp2的下调也可以抑制MR细胞的脱落和粘附作用;11)MTT结果显示Skp2下调后可以增加MR细胞对甲氨蝶呤的敏感性;12)同时我们还发现Skp2下调后,MR细胞的EMT表征蛋白改变,E-caderin和ZO-1的表达升高,而Slug、N-caderin和Vimentin的表达下降,提示Skp2下调可以逆转MR细胞的EMT过程。结论:Skp2的高表达可促进骨肉瘤细胞生长、抑制骨肉瘤细胞凋亡;此外,Skp2可促进骨肉瘤细胞周期进入S期。Skp2可以促进骨肉瘤细胞的侵袭、迁移,Skp2下游细胞迁移、凋亡及周期负调控分子E-caderin、Foxo1、p21、p57的表达明显下调,而促进肿瘤转移侵袭的MMP-9分子表达则明显上调。转染Skp2 siRNA,降低Skp2表达后,骨肉瘤细胞生长、侵袭、迁移及周期进程均受到抑制,而凋亡细胞增加,周期抑制分子p27,p57和其它底物Foxo1、E-cadherin的表达升高,但pAKT的表达明显减弱。本研究证实Skp2是骨肉瘤治疗的靶向目标,通过抑制Skp2表达,将有助于在骨肉瘤患者中获得更好的临床疗效。构建MTX耐药的骨肉瘤细胞发生EMT,Skp2信号通路和耐药的发生密切相关。Skp2参与调控耐药细胞EMT的过程,侵染Skp2 shRNA稳定下调Skp2,可以部分逆转耐药细胞EMT表征、提高耐药细胞对MTX的敏感性。因此,Skp2可能是治疗骨肉瘤的一个潜在靶点,药理性抑制Skp2很有可能成为克服OS患者耐药的一种新的治疗策略。