研究背景骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是全球范围内中老年人关节致残率逐年增长的首位病因,也是影响这一群体生存生活质量的主要慢性关节疾病。传统观点认为机械压力所致的软骨退变是OA启动的主要致病因素。但随着对OA发病机制的深入了解,滑膜炎性反应、软骨下骨硬化、异常骨重塑及骨髓丢失、骨赘形成等病理变化同样是OA典型表现。迄今,临床OA治疗策略较为局限,主要为疼痛管理和外科手术进行关节置换,且大部分患者就诊时OA已处于晚期保守治疗的可能性较小,这就对OA发病机制的研究更加迫切。实际上,早在20世纪70年代学者们便开始对OA软骨下骨的病理变化进行研究,这一过程涉及多种细胞代谢和骨微结构的变化。近些年来,研究发现骨和软骨组成的功能单元复合体在OA发生发展中充当至关重要的角色,大量微血管及神经侵入这一界面后明显加速软骨退变进程。这些血管神经的形成转化为物质转运渠道,一方面转运自软骨下骨合成释放的小分子物质至关节软骨,另一方面破坏软骨下骨与关节软骨的正常代合成谢微环境从而形成恶性循环促进OA发展。故而对骨-软骨界面微血管形成机制的研究将为OA提供新的治疗思路。研究目的先前的研究表明,T3(3’3’5-三碘甲腺原氨酸)局部生物利用度的提高促进骨关节炎的发生,但机制尚不明确。基于上述研究背我们旨在调查OA成骨细胞中甲状腺激素受体(THRs)信号对软骨下骨微血管形成的作用并为OA治疗提供可能的新靶点。研究方法1.检测OA组与正常组参与者血清TT3、TT4水平的差异;2.自人OA软骨下骨组织标本中分离培养成骨细胞,通过免疫组织化学、免疫荧光染色、Western blot(总蛋白和核蛋白)和RT-q PCR检测软骨下骨组织和成骨细胞中THRα、THRβ的表达并与正常组比较差异;3.T3浓度依赖性和时间依赖性刺激OA成骨细胞后通过ELISA和Western blot检测血管形成相关因子表达水平(VEGF、HIF-1α),并探讨PI3K/AKT信号传导通路在T3刺激血管形成中的作用;4.建立成骨细胞缺氧模型,PX-478抑制HIF-1α表达验证其在VEGF表达中的中介调节作用;5.利用小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)敲低成骨细胞THRα和THRβ基因表达后通过ELISA和Western blot检测VEGF、HIF-1α的表达,荧光原位杂交实验确定THRα、THRβ与VEGF在细胞内的共定位情况;6.建立成骨细胞和软骨细胞共培养模型,IL-1β刺激软骨细胞模拟体内骨关节炎微环境,经过si RNA敲低成骨细胞THR m RNA表达后检测软骨细胞VEGF表达水平;7.DMM法小鼠OA造模验证体外实验结果,小鼠膝关节腔注射si THRα后利用免疫组化检测软骨下骨血管形成活性及关节软骨MMPs(金属基质蛋白酶)的表达水平,并对膝关节软骨进行OARSI评分及HE、番红固绿染色,micro CT对软骨下骨进行扫描并选取矢状位内侧软骨下骨区域三维重建采集骨微结构参数进行分析。研究结果1.OA组血清甲状腺激素水平与正常组无差异且人OA软骨下骨组织及成骨细胞中THRα、THRβ表达上调,Western blot实验及免疫荧光染色示二者细胞内核转位增强;2.T3刺激OA成骨细胞培养24h和48h后能够通过PI3K/AKT通路上调VEGF、HIF-1α的表达且THRα核转位增强,而高浓度T3(10-5 M)则抑制VEGF、HIF-1α的表达;3.缺氧环境下PX-478抑制HIF-1α后OA成骨细胞VEGF表达减少;4.敲低OA成骨细胞THRα后VEGF和HIF-1α表达明显下降,而敲低THRβ后二者表达无变化,荧光原位杂交实验示THRα与VEGF在OA成骨细胞中共定位;5.在OA小鼠膝关节腔注射si THRα后膝关节组织OARSI评分降低、软骨下骨血管形成减少、软骨蛋白多糖丢失减少、软骨细胞MMP9和MMP13表达减少、硬化的软骨下骨板变薄且micro CT扫描提示骨矿物质密度和骨体积分数升高。研究结论1.局部T3生物利用度的提高在OA软骨下骨中由THRα和THRβ表达升高所致;2.T3通过PI3K/AKT信号传导通路上调OA成骨细胞血管形成相关因子表达,THRα核转位增强参与此过程;3.软骨下骨缺氧环境中HIF-1α调节OA成骨细胞VEGF的表达;4.OA成骨细胞中异常的THRα信号调控软骨下骨微血管形成,抑制THRα可缓解OA进展。