猪蛔虫(Ascaris suum)是一种寄生线虫,在分类上隶属线虫纲(Nematoda)、蛔目(Ascaridata)、蛔科(Ascaridae)、蛔属(Ascaris),在全球广泛流行,猪群感染率高达50%-70%。成虫寄生于猪小肠肠腔内,在猪体内寄生的数量巨大,可达1000条以上,常引起肠腔堵塞,扰乱机体的消化吸收,导致消瘦、出血及生长不良。据估计雌性成虫每天的产卵量可多达20万到200万个。猪蛔虫幼虫在猪体内移行会损伤肺脏和肝脏,并引起其他继发性疾病,导致幼龄猪死亡,严重危害养猪业的发展。另外猪蛔虫在很长时间内被认为和人蛔虫是一个种,猪蛔虫幼虫还会在人体寄生,引起眼幼虫移行症等。所以,对猪蛔虫病的研究也具有重要公共卫生学意义。MicroRNA (miRNA)是一类内源性的非编码小RNA,长度通常约18～22nt,广泛存在于真核生物中,具有发育阶段特异性、时序性或者组织特异性的表达特点,在转录后水平调节个体生长发育相关基因的表达。研究表明,寄生线虫可以通过miRNA实现对宿主和自身基因表达的精确调控,提高感染和增殖的能力,逃避免疫监视。对这种机制的充分了解和把握有助于更好地理解寄生线虫的调控机理和性别分化机制,从而很可能成为免疫预防或化学治疗的“关键”靶分子。为此,本文分别对猪蛔虫和人蛔虫成虫期miRNA进行深度测序,并对两者的表达谱比较分析；同样,对猪蛔虫不同发育期miRNA进行深度测序,对表达谱进行分析比较；最后,选取三个miRNA (miRNA-36、miRNA-100b、miRNA-81a)为研究对象,进一步研究其生物学功能。结果如下：一、猪蛔虫与人蛔虫成虫期miRNA表达谱及比较分析采用深度测序获得猪蛔虫人蛔虫成虫miRNA表达谱数据,我们从人蛔虫猪蛔虫成虫样品中分别获得了171及494 miRNA候选者。其中74个miRNA是两种蛔虫共有的,97和420个miRNA是人蛔虫猪蛔虫特异的。靶基因及功能注释分析显示两类蛔虫的很多靶基因与卵巢信息蛋白,卵黄蛋白原和软骨素蛋白多糖有关。富集分析显示两种蛔虫的大多数miRNA靶基因是相似的,但是两种蛔虫靶基因数目不同,而某些功能如NADH脱氢酶及电子转运功能等是猪蛔虫特有的。猪蛔虫人蛔虫miRNA表达谱比较研究结果为猪蛔虫人蛔虫是一个种提供了一种证据。二、猪蛔虫不同发育阶段miRNA高通量测序及生物信息学分析建立了猪蛔虫7个不同发育(包含虫卵,肝阶段L3期幼虫,肺阶段L3期幼虫,L4期幼虫,L5阶段幼虫,成熟雌性成虫,成熟雄性成虫)时期的文库。高通量测序后共获得8516852条unique reads。在7个阶段分别共获得565、215、157、128、174、486和498个miRNA,其中通过同源性分析分别有75、95、82、77、79、80和85个miRNA是已知的,其余都是新miRNA。通过比对分析获得75个miRNA在7个发育阶段共同表达,437个miRNA在胚胎期特异表达,还有一些在胚胎期表达量非常高,如asu-miR-44b和asu-miR-5350a,暗示它们可能与胚胎发育有关。165个miRNA是发育期特异表达的,asu-miR-184、asu-miR-5348、 asu-miR-5351、asu-miR-5352、asu-miR-5367和asu-miR-72在L3期表达量特别高,可能与三期幼虫的感染性有关。还有一些miRNA在两个相邻阶段表达非常高,推测与发育期过渡有关,如asu-miR-239、asu-miR-279c、asu-miR-5357、 asu-miR-5364和prd-let-7可能与幼虫到成虫期过渡有关。RNAhybrid预测共得到1291个靶基因,GO分析发现很多靶基因在猪蛔虫生长发育等方面发挥重要作用,如与线虫发育及寿命有关的,胚胎发育,蜕皮,发育期过度,生殖,产卵,迁移,形态改变等,富集分析显示预测靶基因主要集中在催化及结合功能,其次是生物进程,细胞进程,代谢进程,发育进程。选择3个卵阶段特异表达的miRNA及5个所有发育阶段共表达的miRNA进行了荧光定量分析,结果显示5个阶段共表达miRNA的定量结果与预测均相符,卵时期特异表达的3个miRNA与测序结果不符。三、猪蛔虫三个miRNA的功能特征初步研究设计合成了3个miRNA (miRNA-36, miRNA-100a, miRNA-81a)的1nimic、 inhibitor及相应的阴性对照,通过浸泡的方式导入蛔虫幼虫体内,用荧光定量来检测miRNA及其靶基因的丰度变化。每个miRNA的功能用猪蛔虫幼虫的感染率及其从小鼠肝、肺回收的猪蛔虫虫体长度和宽度来评价。miRNA mimic浸泡进入后的虫体的相应miRNA的表达水平上升,抑制剂处理虫体的相应miRNA的水平下降,表明通过浸泡可以成功导入miRNA的mimic及inhibitor。miRNA mimic的导入在体内不发挥明显的功能效果,虫体的感染力生长发育没有明显变化,表明内源miRNA的表达水平可以维持虫体的正常的发育。miRNA-36 inhibitor处理组每只小鼠的幼虫感染量为71.40±25.22个,明显低于inhibitor阴性对照(170.89±12.45个)及空白组(230.30±17.47个),差异显著(P<0.05)；inhibitor处理组的虫体长度为410.57±71.31μm,宽度为16.20±2.43μm,明显低于阴性对照组及空白组(P<0.01)。miRNA-100a inhibitor处理组每只小鼠的平均感染量为42.40±25.22个,与阴性对照(140.89±12.45μm)及空白(178.30±17.47μm)相比差异显著；inhibitor组的猪蛔虫平均长度为390.67±85.31μm,宽度24.89±2,47μm,与空白组(482.30±69.56μm,23.21±1.45μm)相比差异不显著。miRNA-81a inhibitor处理组每只小鼠的平均感染量为123.40±12.22个,与阴性对照(90.89±15.45个)及空白(178.30±17.47个)相比差异不显著。三种miRNA inhibitor都可以引起miRNA靶基因水平的上升。