头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC,简称头颈鳞癌)占到全身恶性肿瘤的6%,每年全世界新增600,000例病人,位居全身恶性肿瘤第六位,且发病率呈现逐年上升趋势。尽管在过去的三十年中,整复外科、微创外科、精准放疗、化疗以及单抗治疗等治疗方式取得的巨大进展,头颈鳞癌的五年生存率依然只有约53%。因此,结合当今飞速发展的医学基础科学研究及交叉学科研究,在深刻认知头颈鳞癌发生、发展、复发及转移的机理上,寻找有效的治疗靶点以及探索有效的治疗方式,将大大提高我们对于头颈鳞癌的认识,同时对于改善头颈鳞癌的预后具有重要的意义。头颈鳞癌的一大特点就是肿瘤组织的异质性以及肿瘤组织构成的复杂的肿瘤微环境,肿瘤干细胞以及肿瘤浸润免疫细胞(髓源性抑制细胞)是其中非常重要的两种组成部分。肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)是肿瘤组织中一小部分具有无限增殖、自我更新及多分化潜能的细胞,肿瘤发生、发展、复发、转移以及化疗抵抗的根本原因,因此有效靶向肿瘤干细胞对于头颈鳞癌的治疗具有重要作用9-12。肿瘤免疫治疗作为Science杂志评选的2013年十大科技突破之一13-15,目前在头颈鳞癌的研究仍然方兴未艾。头颈鳞癌作为一种免疫抑制性肿瘤,其中的髓源性抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)对于头颈鳞癌的的免疫抑制状态的形成及维持具有重要作用。信号转导与转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription 3, STAT3)在不同的细胞及组织当中广泛存在,是一种具有信号转导以及转录调控能力的脱氧核糖核酸结合蛋白16-19。STAT3蛋白存在于细胞浆当中,被激活之后形成磷酸化二聚体,进入胞核,与核内DNA特定序列结合,调控特定的下游信号通路,从而达到调控细胞生命活动的目的。STAT3作为一种具有多种功能的转录调控因子,可以在肿瘤微环境中的肿瘤细胞以及免疫细胞当中被持续激活,通过这两个方面促进肿瘤的发生、发展。纳米技术(nanotechnology)作为21世纪战略技术的制高点。相对于传统化疗及靶向药物,利用纳米技术发展起来的纳米载药系统最大的优势就是：增加药物给药剂量、改善生物利用程度、增加靶向能力以及减轻毒副作用20-23。传统肿瘤研究领域,人们往往关注本学科的基础问题,从机制研究到转化研究比较欠缺。如何结合临床现状发现问题,根据问题探究问题所产生的原因,是比较传统的套路,以这种简单单一的思维方式去思考肿瘤这一具有进化能力的有智慧的存在,反而付出了很多努力却难以达到满意的效果。因此将最新的研究理念(多效应靶点)以及最新的纳米技术结合起来,从多学科多中心肿瘤治疗的角度出发,寻找可以同时靶向多种肿瘤特性的分子靶点应该是未来的趋势。第一部分探索STAT3信号对于头颈鳞癌干细胞的调控作用及其在头颈鳞癌化疗耐药中的作用目的：头颈鳞癌干细胞在头颈鳞癌发生发展、复发侵袭及转移等特性中都发挥着重要的作用。本部分内容研究目的在于探究多功能信号分子STAT3信号在头颈鳞癌中表达情况；其与肿瘤干细胞标志物(SOX2、OCT4、ALDH1、CD44)的相关性；其在头颈鳞癌化疗耐药中的作用以及阻断STAT3信号对头颈鳞癌肿瘤干细胞的抑制作用。方法：首先通过使用公共数据库Oncomine(癌症微阵列数据库)深入挖掘STAT3基因在已有癌症研究当中的表达情况；利用免疫组化检测本课题组建立的头颈鳞癌组织芯片当中STAT3以及肿瘤干细胞标志物SOX2、OCT4、ALDH1、CD44的表达情况；通过Aperio Scanscope数字化病理技术对其表达情况进行定量分析,同时利用Pearson correlation(皮尔森相关性)分析和Cluster(聚类分析)对其在不同组织中的表达进行聚类分析；通过采用克隆微球实验(sphere formation assay)、流式细胞术肿瘤干细胞表面标志物(CD44)、流式细胞术侧群细胞检测(side population assay)评估STAT3特异性小分子抑制剂对于头颈鳞癌干细胞的影响,使用头颈鳞癌裸鼠模型检测STAT3特异性小分子抑制剂联合传统化疗药物(顺铂、5-氟尿嘧啶、多西他赛)分析STAT3通路阻断对于头颈鳞癌化疗耐药的影响。结果：持续活化的STAT3信号在头颈鳞癌中的表达显著高于正常粘膜,关联性分析结果显示STAT3与肿瘤干细胞标志物(SOX2、OCT4、ALDH1、CD44)正相关。体外体内实验表明阻断STAT3信号可以有有效抑制头颈鳞癌肿瘤干细胞的增殖以及克服由于肿瘤干细胞引起的头颈鳞癌对于传统药物的化疗耐药。结论：头颈鳞癌组织中以及头颈鳞癌经术前诱导化疗组织中都可以发现STAT3信号的持续活化且与头颈鳞癌干细胞密切相关,阻断S TAT3信号可以有效抑制头颈肿瘤干细胞,提示STAT3信号在头颈鳞癌干细胞维持中的重要作用。第二部分探索STAT3通过调控髓源性抑制细胞在头颈鳞癌肿瘤免疫选逸中的作用目的：髓源性抑制细胞在肿瘤免疫逃逸中起重要作用,而STAT3作为一种多功能调节分子对于引起肿瘤免疫逃逸的一群同样发挥着重要作用。本部分研究目的是探索S TAT3信号在这群髓源性抑制细胞上的表达情况及作用,以及检测阻断ST/ T3信号在头颈鳞癌肿瘤免疫逃逸中的作用。方法：采用免疫组化检测STAT3信号以及髓源性抑制细胞信号(CD11b、Gr1, MDSC; CD68、CD163, TAM)在头颈鳞癌组织芯片的表达情况,通过Aperio Scanscope对其表达情况进行定量分析,利用Pearson correlation分析和Cluster对其在不同组织中的表达进行聚类分析；采用免疫荧光双染检测STAT3信号在Tgfbrl/Pten双基因条件性敲除小鼠髓源性抑制细胞上的表达情况；使用STAT3特异性小分子抑制剂作用于免疫健全时间可诱导组织特异性Tgfbrl/Pten双基因条件性敲除头颈鳞癌小鼠,采用免疫流式技术检测转基因小鼠中免疫抑制性细胞MDSC、TAM的变化以及效应性细胞CD4、CD8T细胞数量的改变,检测阻断STAT3信号对于头颈鳞癌抗肿瘤免疫增强的作用。结果：头颈鳞癌中STAT3信号与髓源性抑制细胞信号的表达高度相关,免疫荧光双染结果显示STAT3表达在髓源性抑制细胞上,阻断STAT3信号可以有效降低转基因小鼠中免疫抑制性细胞MDSC、T AM的数量,提高效应性免疫细胞CD4、CD8T细胞的数量,从而提高头颈鳞癌抗肿瘤免疫效应。结论：阻断STAT3信号对肿瘤免疫抑制性细胞群体具有明显的抑制效应,并增强免疫效应细胞的作用,说明阻断STAT3信号可以有效提高头颈鳞癌抗肿瘤免疫效应。第三部分探索明胶纳米颗粒包裹的STAT3抑制剂及多西他赛对头颈鳞癌的作用目的：以上两部分的研究结果证明STAT3信号在头颈鳞癌肿瘤干细胞以及肿瘤免疫细胞两方面都发挥着重要的作用,STAT3作为头颈鳞癌治疗靶点显示出巨大的可能性。本部分实验的目的是通过采用生物相容性良好的明胶纳米材料对STAT3小分子抑制剂及传统化疗药物多西他赛(Docetaxel,DTX)进行纳米载药体系荷载,探索新型纳米载药技术在头颈鳞癌基础研究中的应用前景。方法：采用免疫组化以及公共数据库TCGA检测明胶酶(MMP-2、MMP-9)在头颈鳞癌中的表达情况；将生物相容性良好的明胶材料制备成纳米颗粒,使用透射电镜等手段检测纳米颗粒的特性；使用CCK-8检测明胶颗粒的生物毒性；检测STAT3小分子抑制剂及多西他赛荷载于明胶纳米颗粒效率：使用头颈鳞癌细胞系体外实验通过比较STAT3小分子抑制剂、多西他赛单独给药以及明胶荷载的药物之间的治疗效果,检测纳米颗粒荷载药物相对于传统药物的优势。结果：两种明胶酶在头颈鳞癌中表达明显升高,制备的明胶纳米颗粒具备显著的纳米颗粒特性,单纯纳米颗粒对于正常细胞系及头颈鳞癌细胞系都不会产生任何杀伤作用,STAT3小分子抑制剂及多西他赛都可以有效的被荷载与纳米颗粒当中,相对于单纯小分子抑制剂,不降低其本身的生物学效应,展现了良好的治疗效果。结论：明胶纳米颗粒荷载S TAT3、分子抑制剂以及多西他赛不影响药物本身作用的情况下,同样展现良好的抗肿瘤作用。