论文部分内容阅读
目的:鹅不食草(Centipeda minima(L.)A.Br.Et Ascher.)为菊科(Compositae)石胡荽属植物鹅不食草的干燥带花全草,是以“通窍止咳”为主要功效的常用辛温解表药,被广泛视为治疗鼻炎、头风的要药。本课题主要研究鹅不食草挥发油和总黄酮的提取工艺、纯化工艺和指纹图谱,并进行药效学实验,筛选疗效确切的作用部位,研究制备合适的临床应用剂型,为鹅不食草临床治疗变应性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)提供一定的参考和依据。方法:(1)采用单因素试验结合正交试验设计优选鹅不食草挥发油的水蒸气蒸馏提取工艺,并用单因素试验结合Box-Behnken响应面试验优选鹅不食草总黄酮回流提取工艺,确定两种部位的最佳提取工艺;(2)建立UV法测定鹅不食草总黄酮含量的方法,并作为优选总黄酮提取工艺、纯化工艺的指标;(3)采用鸡卵白蛋白为主要致敏原,氢氧化铝为免疫佐剂,采用腹腔注射与鼻腔激发结合的方式制作大鼠变应性鼻炎模型;(4)分别按照最佳提取工艺提取鹅不食草挥发油和总黄酮,以曲安奈德喷雾剂为阳性对照,选择动物行为学评分、血浆细胞因子(包括IFN-γ、IL-4、TNF-α、IgE)含量、鼻中隔黏膜HE染色切片为考察指标,研究挥发油和总黄酮对AR的治疗作用;(5)建立HPLC法测定鹅不食草总黄酮中芦丁含量的方法,并作为优选鹅不食草总黄酮纯化工艺的指标;(6)优选D101大孔吸附树脂纯化鹅不食草总黄酮的最佳工艺,并建立纯化液的指纹图谱;(7)以纯化后鹅不食草总黄酮为主要活性成分,优选鼻喷雾剂的制备工艺。结果:(1)水蒸气蒸馏法提取鹅不食草挥发油的最佳工艺为:将鹅不食草药材粉碎,过50目筛,加8倍量的水,浸泡4h,提取6h,挥发油提取率约为0.17%;乙醇回流法提取鹅不食草总黄酮的最佳工艺为:将鹅不食草药材粉碎,过60目筛,石油醚脱脂,65%乙醇回流提取,料液比16倍,提取2次,提取时间为每次2.8h,所提取总黄酮含量约为31.59mg/g;(2)建立了UV法测定鹅不食草总黄酮含量的方法,样品采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法,在505nm下检测供试品吸光度值,以对照品浓度(mg/mL)为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,线性方程为Y=9.7925x+0.0644,R2=0.9985;(3)模型组大鼠行为学评分明显高于空白组(P<0.01),各给药组大鼠行为学评分明显低于模型组(P<0.01);与空白组比较,模型组大鼠血浆IFN-γ含量显著降低(P<0.01),IL-4、TNF-α、IgE含量显著升高(P<0.01),与模型组比较,各给药组治疗后,血浆中IFN-γ含量显著升高(P<0.01,P<0.05),IL-4、TNF-α、IgE含量显著降低(P<0.01),挥发油低、中剂量组、总黄酮低剂量组和曲安奈德组对IFN-γ含量的影响无显著性差异;组织学切片显示,鹅不食草总黄酮和挥发油均可修复假复层柱状纤毛上皮结构,消除血管淤血扩张和水肿,使上皮细胞形态恢复正常,且治疗效果在设计的剂量范围内,与剂量呈正相关关系;(4)建立了HPLC法测定鹅不食草总黄酮中芦丁含量的方法,以浓度(μg/mL)为横坐标,峰面积(mAU)为纵坐标绘制标准曲线,线性方程为Y=45.21x-58.04,R2=0.9994;(5)D101大孔吸附树脂纯化鹅不食草总黄酮的最佳工艺为:上样液浓度为总黄酮浓度4.00mg/mL(芦丁浓度为20.45μg/mL),上样液体积为5BV(15mL),上样流速2BV/h,上样后用5BV纯水洗去水溶性杂质,洗脱液为50%乙醇,洗脱液用量为8BV(24mL),洗脱速率为3BV/h;(6)建立了总黄酮纯化液的指纹图谱,结果匹配的峰中有11个共有峰,所有共有峰在560min内出峰,峰型较好、基线平稳,各峰能实现良好的分离;(7)优选的鼻喷雾剂制备工艺为:将鹅不食草总黄酮干粉用研钵研磨并过80目筛,得总黄酮细粉,备用,取容器A加入处方量的丙二醇和苯扎氯铵,加入处方量的纯水,搅拌溶解,同时取容器B加入处方量的总黄酮细粉和吐温-80,使其充分混匀并均匀分散,加入少量A中溶液,涡旋混匀5min,继续添加A中溶液至50mL,搅拌均匀,过滤,得黄褐色药液,分装,即得。结论:(1)鹅不食草挥发油最佳提取工艺验证试验RSD=2.83%<5%,鹅不食草总黄酮最佳提取工艺验证试验RSD=3.10%<5%,说明两种提取工艺均稳定可行,可分别用于挥发油和总黄酮的提取;(2)鹅不食草总黄酮和挥发油均可以通过上调IFN-γ的表达,下调IL-4、TNF-α的表达,从而修复AR引起的炎性细胞浸润和水肿等典型病理改变,改善AR大鼠流涕、喷嚏等病理症状,发挥治疗AR的作用,鹅不食草总黄酮和挥发油的疗效在一定程度上均优于曲安奈德鼻喷雾剂,且总黄酮的疗效略优于挥发油;(3)纯化前后干粉中总黄酮含量分别为17.51%和61.29%,纯化倍数为3.50倍,转移率为87.09%,纯化前后干粉中芦丁含量分别为0.072%和0.241%,纯化倍数为3.35倍,转移率为82.58%,样品损失少,纯化效率较高,且验证试验RSD小于2%,表明本纯化工艺稳定可行,可用于鹅不食草总黄酮的纯化;(4)10批鹅不食草总黄酮纯化液相似度均大于0.9,说明10批纯化液相似度高,进一步表明本研究所建立的鹅不食草总黄酮纯化工艺稳定可靠,在鹅不食草总黄酮纯化液的质量控制方面具有一定的指导意义;(5)从鼻喷雾剂的制备工艺着手,检查了制剂的每瓶总喷次、每喷喷量及装量差异,结果稳定可靠,且制备工艺相对简单,符合工业生产基本要求。