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第一部分 SCN9A基因错义突变导致先天性无痛症——出人意料的基因型-表型关系背景:先天性无痛症（Congenital Insensitivity to Pain,CIP）是一种极为罕见的常染色体隐性遗传病,是由SCN9A基因突变导致其编码的Nav1.7功能缺失所致。迄今为止,全球报道的CIP患者仅40余例,对于CIP患者基因型-临床表型之间的复杂关系仍然不清。本课题组作为中国CIP的主要研究团队,2009年至今,仅收集到4例中国CIP患者,并于2011年发表了中国唯一一篇关于CIP患者的研究报告。基于此,本文重点研究中国仅有的3例未报道的CIP患者的基因型和表型关系。目的:筛查罕见病CIP中国患者的突变基因,研究基因型-表型之间的关系,探讨其致病机制。方法:1.签署患者、患者家属的知情同意书;收集患者及其家系的疾病信息,并记录患者、患者家属的临床表型（症状、影像学等）;收集血样,从全血中提取基因组DNA,通过基因芯片对患者进行基因突变检测,检测基因包括:SCN9A、SCN10A、SCN11A、NGF、NTRK1、PRDM12等60个与疼痛相关的基因。2.针对不同突变类型的基因,进行生物信息学分析:针对SCN9A基因的移码突变和突变所在区域、读码框,分析移码突变对Nav1.7蛋白结构的影响;针对SCN9A基因的内含子突变和所在部位,分析内含子突变对SCN9A基因剪接功能的影响;针对SCN9A基因的错义突变,利用Clustal Omega软件分析突变所在区域氨基酸残基的保守性,利用Polyphen2软件和SIFT软件预测错义突变对Nav1.7功能的影响。3.构建SCN9A野生型和突变型载体,用载体转染HEK293细胞,获得能够表达野生型或突变型Nav1.7的HEK293细胞。针对内含子剪接区突变,进行体外剪接验证,检测内含子突变对Nav1.7 mRNA剪接的影响;针对错义突变,通过全细胞膜片钳实验,确定错义突变对Nav1.7电生理功能的影响;通过逆转录PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）、Western Blotting和免疫荧光检测,确定错义突变对Nav1.7表达水平和亚细胞定位的影响。结果:1.3例CIP患者的主要临床表型为:1)先天性无痛:患者对伤害性刺激（如打针抽血、损伤、烫伤等）均无疼痛表现和不愉快表情,且常常发生自残,如咬伤舌头、手指等行为;2)嗅觉缺失,不能区分水、酒精和白醋的气味。2.3例CIP患者均为复合杂合突变,共检测出6个未报道的SCN9A基因突变,且未检测到其他基因突变。患者1携带复合杂合移码突变:c.850delG（p.Glu284Lysfs*3）和c.129141delTGAAGAAGCCCCA（p.Asp43Glufs*43）;患者2携带复合杂合内含子突变:c.4174-1G>C（Intron 22）和c.4228-10A>G（Intron23）;患者3携带复合杂合错义突变:c.296G>A（p.Arg99His）和c.2749T>G（p.Trp917Gly）。3.生物信息学分析发现:患者1携带的SCN9A移码突变c.850delG（p.Glu284Lysfs*3）和c.129141delTGAAGAAGCCCCA（p.Asp43Glufs*43）,分别位于Nav1.7蛋白domain I第一次跨膜区域和N端,导致Nav1.7蛋白在此处表达终止,产生截断型Nav1.7通道蛋白,进而造成Nav1.7四个结构域几乎全部缺失。患者2携带的SCN9A内含子突变c.4174-1G>C和c.4228-10A>G,分别位于Intron 22和Intron23剪接区域,会造成Nav1.7 mRNA的剪接异常。患者3携带SCN9A错义突变c.296G>A（p.Arg99His）和c.2749T>G（p.Trp917Gly）,这两个突变所在部位氨基酸残基Arg99和Trp917分别位于Nav1.7蛋白N端和domain II离子孔道区域,通过多序列比对发现,这两个氨基酸残基在生物进化过程中、在人类钠通道家族中高度保守;对Nav1.7错义突变的致病性预测结果显示,Nav1.7突变p.Arg99His和p.Trp917Gly具有很强的致病性,PolyPhen-2预测结果为:0.953和1.000（分值越高,越具有致病性）。4.对患者2的内含子突变进行体外功能验证发现:内含子突变c.4174-1G>C和c.4228-10A>G会导致Nav1.7 mRNA剪接异常,进而产生截断型Nav1.7。5.对患者3的错义突变进行全细胞膜片钳检测发现:与野生型Nav1.7通道相比,p.Arg99His突变型Nav1.7通道电流明显减少,约为野生型的一半;p.Trp917Gly突变型Nav1.7通道电流几乎消失。Nav1.7表达水平检测结果显示,p.Arg99His突变和p.Trp917Gly突变均不影响Nav1.7 mRNA表达;p.Arg99His突变导致Nav1.7通道蛋白表达水平明显下降,约为野生型的48%（P<0.001）,细胞膜Nav1.7表达水平也明显下降,约为野生型的43%（P<0.001）,而p.Trp917Gly突变并没有影响Nav1.7通道蛋白表达水平（P>0.05）。结论:1.3例中国CIP患者的主要临床表型是先天性无痛和嗅觉缺失,3例患者均携带复合杂合基因突变,共携带6个未报道的SCN9A基因突变,未发现其他基因突变。2.患者1的SCN9A基因移码突变和患者2的SCN9A基因内含子突变,最终均产生截断型Nav1.7。3.CIP患者3携带复合杂合SCN9A基因错义突变,c.296G>A,p.Arg99His和c.2749T>G,p.Trp917Gly。对患者3携带的2个错义突变进行全细胞膜片钳实验发现,CIP患者3的突变Nav1.7仍然保留了部分通道功能,但患者表现为无痛,这与之前研究结论“Nav1.7功能完全缺失导致无痛”截然不同,患者3这种出人意料的基因型-表型关系非常值得关注。4.对患者3携带的错义突变进行电生理和表达水平的检测发现,位于Nav1.7 N端的氨基酸残基p.Arg99在维持Nav1.7表达和膜定位中发挥重要作用,位于Nav1.7离子孔道形成部位的氨基酸残基p.Trp917在维持Nav1.7正常电生理功能中发挥重要作用,这将有助于Nav1.7靶向镇痛药物的开发。第二部分DRG内Nav1.7表达在术后疼痛中的作用研究背景:急性术后疼痛会严重影响患者术后恢复和生活质量,是目前临床上亟待解决的一大难题,但其发病机制尚未完全清楚。目前认为,外周伤害性感受器兴奋性增加是术后疼痛发生的重要机制,因此,从源头上阻止疼痛信号向中枢的传递是预防和治疗术后疼痛的关键。在疼痛信号的产生和传导过程中,背根神经节（Dorsal Root Ganglion,DRG）是机体疼痛电信号向脊髓及以上中枢传递的纽带,其中SCN9A基因编码的钠通道Nav1.7是介导DRG神经元动作电位的最主要通道。Nav1.7通过决定动作电位起始阈值调节神经元兴奋性,进而在疼痛信号的产生和传导中发挥重要作用。Nav1.7功能亢进会引起伤害性感受器过度兴奋,进而导致红斑肢痛症、阵发性剧痛等疾病;Nav1.7功能缺失会引起伤害性感受器抑制,进而导致先天性无痛症。动物实验研究证实,Nav1.7敲除小鼠不再发生神经生长因子（Nerve Growth Factor,NGF）、弗氏完全佐剂（Complete Freund’s Adjuvant,CFA）等引发的急性炎性疼痛,Nav1.7抑制剂可抑制大鼠的急性炎性疼痛和急性刺激性疼痛。然而,目前关于Nav1.7在急性术后疼痛中的作用尚无研究。课题组前期研究发现,编码Nav1.7的SCN9A基因多态性影响一般人群基础疼痛敏感性和手术患者术后疼痛敏感性;CIP患者不仅对急性伤害性刺激（如打针、骨折等）表现为无痛,而且手术后也感觉不到疼痛。据此,我们推测DRG内Nav1.7增加可能在术后疼痛中发挥重要作用,有必要进一步对手术后DRG内Nav1.7的表达和作用进行深入研究。目的:检测DRG内Nav1.7通道蛋白在足底切口大鼠术后疼痛过程中的动态表达,研究其表达在术后疼痛发生、发展中的作用。方法:1.建立足底切口疼痛大鼠模型,分别在手术前和手术后2小时、24小时、48小时、72小时、120小时进行疼痛的行为学检测:包括机械性疼痛缩爪阈值（Mechanical Withdrawal Threshold,MWT）、热刺激缩爪潜伏期（Thermal Withdrawal Lantency,TWL）和累积疼痛评分,同时利用定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction,Q-PCR）和Western Blotting检测大鼠DRG组织Nav1.7m RNA和蛋白的表达水平。2.将大鼠进行鞘内置管,根据利多卡因试验鉴定置管是否成功,置管成功者用于后续实验。大鼠随机分为四组:空白对照（control）组、足底切口手术（incision）组、Nav1.7干扰慢病毒（SCN9A-RNAi-LV）+incision组、阴性对照慢病毒（NC-LV）+incision组。通过鞘内注射SCN9A-RNAi-LV或NC-LV,3天后建立足底切口疼痛大鼠模型,分别在手术前和手术后2小时、24小时、48小时进行疼痛的行为学测定,包括机械性疼痛敏感性、热痛敏感性和累积疼痛评分。由于在前期实验观察到手术后2小时,大鼠疼痛阈值最低,Nav1.7表达最高,因此本研究选择手术后2小时,通过Q-PCR检测大鼠DRG内Nav1.7 m RNA的表达水平,同时通过Western Blotting和免疫组化检测大鼠DRG组织内Nav1.7蛋白的表达水平。结果:1.足底切口大鼠手术后表现为MWT、TWL明显下降,累积疼痛评分明显增加（P<0.05）,同时大鼠DRG内Nav1.7 m RNA和Nav1.7通道蛋白表达明显增加（P<0.05）。手术后2小时,MWT和TWL下降最明显,Nav1.7 m RNA和Nav1.7通道蛋白表达最高,随后逐渐恢复。2.鞘内注射SCN9A-RNAi-LV后,大鼠DRG内Nav1.7 m RNA和蛋白表达明显下降（P<0.05）,而不影响Nav1.8和Nav1.9表达（P>0.05）。3.与incision组比较,SCN9A-RNAi-LV+incision组大鼠足底切口手术后DRG内Nav1.7增加明显下降（P<0.05）,MWT、TWL明显升高,累积疼痛评分明显降低（P<0.05）。结论:本研究发现,大鼠足底切口手术后,其MWT、TWL明显下降,累积疼痛评分明显增加,同时大鼠DRG内Nav1.7 m RNA和Nav1.7通道蛋白表达明显增加;而鞘内注射SCN9A-RNAi-LV特异性下调大鼠DRG内Nav1.7表达,大鼠手术后MWT、TWL明显升高,累积疼痛评分明显降低,这表明DRG内Nav1.7表达增加参与了术后疼痛的发生、发展。