基因工程技术、基因组学和蛋白质组学技术的发展使得重组蛋白表达技术日益成熟。重组蛋白已经在生物、医药、农业和畜牧兽医等多种领域得到广泛应用。但是,重组蛋白的快速和廉价纯化依然是蛋白质规模化制备的瓶颈。亲和标签是蛋白质纯化的高效工具,能够从污染的宿主蛋白中一步纯化重组的目的蛋白。目前,已经有多种亲和标签被用于蛋白质的表达和纯化。最常用的亲和标签包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S转移酶(GST)标签、葡萄球菌蛋白A(SPA)、硫氧还蛋白(TRX)、小泛素样修饰蛋白(SUMO)和六聚组氨酸标签(6×His)等。使用这些标签需要将标签对应的配体偶联到固相载体上,利用标签与配体的可逆性结合特性,利用合适的洗脱条件将目的蛋白洗脱和纯化。考虑到与将配体偶联到固相载体相关的蛋白纯化费用,商品化纯化介质均十分昂贵且只能重复利用数次等问题,现有的纯化标签系统无一适合蛋白质的规模化制备。本论文利用硫磺菌蘑菇凝集素(LSL)可逆性结合琼脂糖的特性,将其作为融合标签,建立了一种一步纯化LSL标签融合蛋白的方法。不用任何处理的琼脂糖凝胶柱和乳糖溶液分别作为LSL标签蛋白的特异性吸附剂和洗脱剂。所构建的表达载体中在LSL标签的下游含有烟草花叶病毒(TEV)蛋白酶识别位点,方便后续融合蛋白分子中LSL标签的去除。为了纯化不含标签的目的蛋白,本论文表达了带有LSL标签的TEV蛋白酶。本研究构建的LSL融合标签表达与纯化系统具有表达蛋白可溶性好、纯化工艺简单、成本低等优点,为实现规模化生产和纯化性状确切的蛋白提供新的思路。研究内容包括以下三个方面:1.硫磺菌蘑菇凝集素融合标签表达载体构建本研究通过合成硫磺菌蘑菇凝集素(LSL)N端含187个氨基酸的糖结合域,并在其下游引入烟草花叶病毒蛋白酶(TEV)的识别位点,通过克隆获得重组质粒p ET-LSL,随后将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌中,经IPTG诱导进行表达。所构建的p ET-LSL重组质粒能够在BL21(DE3)中表达可溶性的硫磺菌蘑菇凝集素,而且所表达的凝集素可以经琼脂糖凝胶柱Sepharose-4B一步纯化,可以得到单纯的凝集素。为构建以硫磺菌蘑菇凝集素为标签的廉价、高效重组蛋白表达和纯化方法奠定基础。2.模式蛋白表达与纯化本研究在硫磺菌蘑菇凝集素融合标签表达载体构建成功后,以该重组质粒为基础,分别以绿色荧光蛋白GFP和PCV2的衣壳蛋白(Cap)为模式蛋白,进一步研究硫磺菌蘑菇凝集素作为融合标签在蛋白表达上的应用。通过克隆的方法,成功构建了重组质粒p ET-LSL-GFP和p ET-LSL-Cap。分别将重组质粒转化至BL21(DE3)宿主菌中,经IPTG诱导进行表达。实验表明GFP和Cap重组蛋白都能以可溶性形式进行表达,可溶性表达水平在90%左右,经琼脂糖凝胶柱Sepharose-4B一步纯化,可以得到单纯的重组蛋白。在荧光下观察重组蛋白LSL-GFP,可以看到明显的荧光,通过Western Blot,重组蛋白LSL-Cap可被PCV2多克隆抗体特异性识别,证明LSL融合标签不影响模式蛋白的生物学活性和抗原性。3.用于切割融合蛋白的TEV工具酶表达与纯化本研究利用硫磺菌蘑菇凝集素作为标签,构建了表达TEV蛋白酶的重组质粒p ET-LSL-TEV,将重组质粒转化至BL21(DE3)宿主菌后,经IPTG诱导表达。实验表明TEV重组蛋白酶以可溶性形式表达,可溶性水平为60%左右,经琼脂糖凝胶柱Sepharose-4B一步纯化后,可以得到单纯的重组蛋白。所表达的TEV蛋白酶具有良好生物学活性,可以将目的蛋白与LSL标签一步分离。总之,本论文研究结果证明硫磺菌蘑菇凝集素LSL可以作为有效的亲和标签,并且具有以下优势:(1)LSL标签可以一步亲和层析纯化融合蛋白;(2)LSL标签可以提高目的蛋白的可溶性,并且对靶蛋白的功能不产生影响。值得指出的是,Sepharose-4B柱经过含0.2 M乳糖的PBS洗净残留蛋白后,再用PBS洗涤,可以多次重复使用。此外,因为琼脂糖本身就是树脂,并且可以作为LSL标签的配体,本研究所使用的方法比传统需要配体固定到树脂上的亲和纯化方法更廉价、方便。