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目的:
1、建立Lewis大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离、培养及鉴定的方法,探讨β-巯基乙醇定向诱导其向神经样细胞分化的可行性,并观察神经元特异性烯醇化酶NSE、胶质纤维酸性蛋白酶GFAP的表达。
2、腹腔输注mAb35以探讨建立实验性自身免疫性重症肌无力(EAMGExperimental autoimmune myasthenia gravis)的方法。
3、探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)的治疗作用及TSG-6(tumor necrosis factor alpha-stimulated gene-6)、MMP-9在其作用中发挥的可能机制,为其应用于临床治疗提供一定的理论依据及实验基础。
方法:
1、BMSCs用全骨髓培养法分离培养获得,观察所培养的细胞形态,通过流式检测细胞表面的CD90、CD29、CD45等标志抗原的表达率,然后用化学诱导剂β-ME定向诱导干细胞向神经元样细胞分化,对诱导后的细胞行免疫细胞化学和WB检测,观察细胞表面NSE及GFAP的表达情况,与未诱导细胞进行对比。
2、本实验建立EAMG动物模型的方法选用的是腹腔输注mAb35,其是一种AChR特异性单克隆抗体,动物成功建模后应用HE染色法观察两组大鼠腓肠肌冰冻切片中炎性细胞的浸润情况,并且应用免疫荧光技术观察大鼠肌肉切片中的AChR数量的改变情况,并分别收集两组大鼠的血清,采用间接ELISA方法检测两组大鼠血清中AChR-Ab含量。
3、选取清洁级环境下饲养的Lewis雌性大鼠30只,将其分为BMSCs移植组(n=10)、EAMG模型对照组(n=10)和正常对照组(n=10)。移植组和模型对照组腹腔注射mAb35建立EAMG模型。分离培养Lewis大鼠的BMSCs进行鉴定后,调整密度至1.5×106/600μL PBS,移植组尾静脉注射细胞悬液600μL,模型对照组和正常对照组同期给予600μL PBS。对3组动物进行Lennon临床评分,实验结束时ELISA法检测血清中AChR-Ab含量,免疫荧光技术观察腓肠肌AChR数量的变化,应用real time RT-PCR研究腓肠肌AChRα、MMP-9 mRNA的表达。体外用10ng/ml TNF-α培养BMSCs24h后用ELISA检测细胞上清TSG-6,并用realtime PCR检测细胞内TSG-6 mRNA表达的改变。
结果:
1、倒置相差显微镜下的BMSCs形态以长梭形为主,流式细胞仪结果示细胞表面标记物CD90、CD29、CD45的表达率分别为99.04%、98.53%、0.01%;化学诱导剂β巯基乙醇诱导后的细胞其细胞形态发生了相应的变化,原本呈长梭形的细胞胞体收缩成球形或者不规则形状,显微镜下所见细胞的折光性较前有明显增强,较多的长突起出现在细胞胞体上,显微镜下这些突起类似于神经元样细胞的树突和轴突;免疫细胞化学染色示NSE阳性表达率为57.6%±8.2%,而GFAP表达为阴性;WB结果示诱导后细胞NSE表达量增加。
2、实验通过腹腔被动输注mAb35上清成功建立了EAMG大鼠动物模型,该方法的成模率为100%,光镜下发现PTMG组肌肉冰冻切片中炎性细胞浸润增多,荧光显微镜下可见PTMG组肌肉切片中AChR表达量明显下调,ELISA法检测结果示PTMG组血清中的AChR-Ab含量明显高于健康对照组。
3、移植组Lennon评分、AChR-Ab含量、AChR mRNA表达均低于模型对照组(P<0.05);免疫荧光检测示模型对照组未见红色荧光,移植组大鼠可见断断续续较为微弱的荧光;TNF-α处理的BMSCs分泌的TSG-6含量明显增高(P<0.01),TSG-6 mRNA表达量也增高(P<0.05);模型对照组MMP-9表达提高(vs正常对照组P<0.05);而移植组vs正常对照组差异无统计学意义。
结论:
1、全骨髓培养法可以获得稳定且高纯度的BMSCs;β-巯基乙醇能够在体外定向诱导培养的BMSCs向神经元样细胞分化。
2、mAb35可成功建立EAMG Lewis大鼠模型。
3、尾静脉输注BMSCs可以改善EAMG模型的临床表现,BMSCs可能通过分泌TSG-6并通过抑制删P-9发挥作用。