目的胆管癌对化疗不敏感,探讨超声空化效应增强吉西他滨化疗胆管癌的方法。首先,按梯次对超声辐照时间-强度参数、吉西他滨用量进行筛选；继之,将单纯吉西他滨、单纯超声辐照、微泡单一变量分别配对分组,通过普通光镜、Hoechst33342凋亡染色荧光观察、激光共聚焦显微镜观测细胞核变化、MTT法抑制率检测等,多途径、多方法评价微泡介导的超声空化效应增强吉西他滨对胆管癌细胞的化疗效果。方法1、脂质微泡的制备将DPPC、MPEG200、DPPA、PEG400等按一定比例,一定冻干工艺程序进行冷冻干燥,制备脂质冻干粉,并以全氟丙烷置换其中的空气,加入溶酶液,按特定程序机械震荡,充分混悬,制备脂质微泡。2、细胞培养将胆管癌细胞以RPMI 1640培养液(10%新生牛血清),37℃、5%CO2条件下培养传代培养,取生长状态良好、相近的对数生长期浓度为1×106的细胞进行分组。3、吉西他滨对胆管癌细胞抑制效果的浓度筛选1)配置吉西他滨溶液：将吉西他滨冻干粉溶于PBS,分别配制多个浓度梯度,0.22μm的滤膜过滤除菌,-20℃储存。2)配制MTT溶液：MTT溶于PBS液中,磁场搅30min,过滤除菌,配成5mg/ml液体,4℃避光储存。3)药物毒性试验：将RBE胆管癌细胞以1×104/孔接种于96孔板内,37℃ 5%CO2条件下培养24 h,将细胞分为七组,每组十三个孔,分别加入不同浓度梯度的吉西他滨溶液100μL,37℃,5% CO2条件下继续培养24h,向各实验组孔内加入MTT 10μL,5 g/L,继续培养4h后吸弃孔内液体,每孔加入100μL DMSO,置摇床上低速震荡15mmin,至蓝色晶体完全溶解后,使用酶标仪于波长490nm处检测吸光度(OD值),计算抑制率,每组重复3次。4、超声辐照空化对胆管癌细胞抑制效果的参数筛选取对数生长期生长状态相近的RBE胆管癌细胞种于6孔板中,浓度1x106/mL,每孔3mL,浮于37℃水浴锅中,超声探头固定于水浴锅下层6孔板底部,距孔板底lcm,分别以超声辐照声强(0W/cm2开始,每次递增0.1W/cm2)和时间(0s开始,每次递增1s)为变量,分为不同治疗组,空化作用后各组经MTT法检测24h时细胞的抑制率,筛选出最佳超声空化参数,为下一步空化增敏吉西他滨化疗奠定基础。5、超声空化增敏吉西他滨对RBE胆管癌细胞的化疗效果评价1)将人胆管癌细胞接种6孔板中,每孔浓度1×105,培养达到80%融合时,选生长状态相近的RBE胆管癌细胞标记为以下6组作为相互对照：a空白对照组；b.单纯超声辐照组；c.单纯吉西他滨组；d吉西他滨超声辐照组；e.微泡介导超声辐照空化组；f.吉西他滨-微泡介导-超声空化增敏组。并按一下方式对每组进行治疗：a组：空白对照组,不作处理；b组：单纯超声辐照组,选用1.2.4中筛选出的最佳超声空化参数辐照6孔板的中胆管癌细胞；c组：单纯吉西他滨组,向孔板中加入1.2.3中筛选出的最适宜吉西他滨用量及浓度；d组：吉西他滨+超声辐照组,同时使用b组、c组中条件进行处理6孔板中胆管癌细胞；e组：微泡介导超声辐照空化组：向孔板中加入1x019个/mL微泡1mL,使用b组中的超声参数辐照孔板,使孔板中的微泡产生空化作用；f组：吉西他滨-微泡介导-超声空化增敏组,在e组的基础上加入化疗用吉西他滨,增敏吉西他滨的化疗效果。2)按以下步骤对各组对胆管癌细胞抑制效果进行评价：1、观察各组癌细胞光镜下形态变化；2、检测各组细胞抑制率,各组胆管癌细胞经治疗后继续培养24h、48h、72h,加MTT试剂(每孔20μL),再培养4小时,吸弃孔内培养液的上清液后加DMSO(每孔150μL),置摇床上低速震荡15分钟,使用酶标仪测定OD值(波长490nm),并计算抑制率,每组重复3次；3、检测各组细胞凋亡情况：各组经治疗后继续培养24、48、72h,终止培养并消化、离心洗涤后,加入10ul Hoechst33342染色液和10ul PI染色液,轻轻混匀后4℃避光孵育15min,置于荧光显微镜下观察各组荧光效果。4、激光共聚焦观测各组胆管癌细胞核变化情况：将各组细胞终止培养并胰酶消化,离心洗涤3遍,以5000L染色缓冲液重悬,加入5μL Hoechst 33342,充分混悬,室温避光孵育20min, PBS冲洗掉多余荧光染液,置于激光共聚焦显微镜下观察各组细胞核变化情况。6、统计学分析a)实验数据处理使用SPSS 19统计软件,计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示,各组数据间的差异显著性分析采用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。b)多个样本构成比的比较采用RxC表资料的矛检验分析；取P<0.05为差异有统计学意义。c)所有数据用均数±标准差表示,采用统计软件spss19.0统计软件分析。多组间均数比较采用单因素方差分析或析因设计的方差分析,组间两两比较采用LSD法,方差不齐者采用Tamhane’s T2法,取P<0.05为差异有统计学意义。结果1、筛选得到吉西他滨对胆管癌细胞抑制的最佳用量为：每1x106个胆管癌细胞,使用200μ-L,浓度0.02mg/mL。2、筛选出最佳超声辐照空化参数：经LSD法检测发现,超声辐射声强介于0～0.6W/cm2增加时,凋亡率随之增加,当声强≥0.6W/cm2时,凋亡率不再增加,结果经方差分析有统计学意义(F=124.30,P<0.001)。同时,我们筛选出了最佳的超声辐照空化参数：当声压2000KPa, PRF80Hz,占空比1.6%,声强0.6W/cm2,机械指数0.9为胆管癌细胞凋亡率达到峰值40.5%的最佳空化参数。3、各组光镜下细胞形态变化情况a组：空白对照组,细胞多数呈类圆形或梭形,贴壁生长,细胞连接紧密,生长舒展,突起较多折光性佳；b组：单纯超声辐照组,细胞多数呈多角形或梭形,呈“铺路石”样生长,细胞形态大部分正常,仅有少数细胞呈梭形；c组：单纯吉西他滨组,贴壁细胞减少,细胞可出现部分破裂,细胞核染色质分布不均,呈致密浓染状,可见部分细胞核固缩、碎裂；d组：吉西他滨加超声辐照组,细胞形态与c组相似；e组：单纯微泡超声辐照空化组,细胞形态大致与b组相似；f组：吉西他滨-微泡介导-超声空化增敏组,细胞体积缩小,细胞膜皱缩,脱落,贴壁细胞数量明显减少,细胞多数呈圆形,大部分聚集融合,有的细胞碎裂呈碎片,胞浆透明度下降,核颜色加深,并出现较多细胞漂浮现象,胞浆透明度下降,折光性增强。4、各组细胞抑制率结果及随时间变化情况：各组经MTT法检测其受抑制情况,观察24h、48h、72h发现：a组空白对照抑制率维持在10%左右,随时间几乎无变化；b组和e组在48h前受抑制与空白对照组差异不大,48小时后逐渐开始对胆管癌细胞产生抑制；有吉西他滨因素干预的c组、d组、f组从24小时开始便对胆管癌细胞有抑制作用,48h时,抑制率分别为25.1%、26.7%、38.1%,c、d组差异不大,72h时,c、d两组抑制率相近,分别为30.1%、31.1%,f组,即吉西他滨-微泡介导-超声空化增敏组对胆管癌的抑制率最高,72小时达52%。对不同组不同时间进行配对样本t检验结果显示：各组48h以后的抑制率明显高于24h时,3个时段间的差异有统计学意义(P<0.05),f组抑制率明显高于其余5组,P<0.001,与其它各组比较有显著统计学差异。5、各组经荧光凋亡显像检测结果比较：各组经Hoechst33342染色凋亡显影比较可见：(1)空白对照组(a组)：细胞核呈低强度均匀蓝色荧光,形态大小比较一致,细胞存活多,活性高,显示为正常细胞核荧光,呈低强度蓝色荧光;(2)单纯超声辐照组(b组)：大多数细胞呈均匀蓝色,形态大小比较一致,少数细胞荧光强度增强,较a组荧光稍强;(3)单纯吉西他滨组(c组)：可见部分细胞染色质密度增高,细胞核开始固缩、凝聚,蓝染亮度增高,细胞荧光强度增强,表现出凋亡状态,呈稍高强度蓝色荧光；(4)吉西他滨超声辐照组(d组)：与c组相近；(5)单纯超声微泡超声辐照组(e组)：大多数细胞呈均匀蓝色,形态大小比较一致,较b组有更多的细胞荧光强度增强；(6)吉西他滨-微泡介导-超声空化增敏组(f组)：大部分细胞染色质密度明显增高,细胞核明显固缩、凝聚,边缘化,蓝染亮度明显增高,细胞荧光强度明显增强,凋亡小体形成,大量细胞呈现边界不清,细胞破碎,贴壁细胞数量明显减少,大量细胞死亡漂浮,细胞多数呈圆形,大部分聚集融合,呈典型的凋亡及死亡细胞,呈高强度蓝色荧光。结论本研究为评价超声空化增敏吉西他滨对胆管癌的化疗效果进行评价,首先完成了超声空化时间-强度的参数筛选,找到最佳超声空化辐照参数：声压2000KPa, PRF 80Hz,占空比1.6%,声强0.6W/cm2,机械指数0.9,接着筛选出适用于本实验试验化疗效果好,能体现差异性,便于差异检测的最适吉西他滨用量及浓度：每1x106个胆管癌细胞,使用200μL,浓度0.02m/mL；其次,将单纯吉西他滨、单纯超声辐照、微泡等单一变量分别配对分组,保证各组间的单一变量,保证试验科学性。最终,在使用最佳超声辐照参数、最适宜吉西他滨剂量后我们通过普通光镜、Hoechst33342凋亡染色荧光观察、激光共聚焦显微镜观测细胞核变化、MTT法抑制率检测等多途径、多方法,检测了各治疗组胆管癌细胞受抑制效果及凋亡情况,评价了微泡介导下超声空化增敏吉西他滨化疗胆管癌细胞效果。充分证明了：微泡介导的超声空化效应引发声孔效应,利于更多的化疗药吉西他滨进入肿瘤细胞,使化疗过程中全身低浓度,局部高浓度,疗效好,副作用小的设想得到试验验证,为临床对胆管癌的化疗提供了一种高效、安全、便捷的非创伤性治疗思路和方法。