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HSP90家族是在进化上高度保守的蛋白家族,在细胞中含量较高,在热休克、重金属、缺氧、酸中毒、细菌病毒侵染等情况下其含量可成倍增加。越来越多的证据表明,HSP90能够参与先天性及获得性免疫应答。
文昌鱼(Amphious)是位于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型,是研究脊椎动物进化的宝贵材料。本文利用分子生物学的方法和手段,克隆到文昌鱼HSP90基因,预测演绎蛋白片段的一级结构,分析该基因在进化中的位置;探讨该基因在正常文昌鱼成体组织中RNA和蛋白的表达水平以及致病微生物冲击条件下该基因在文昌鱼成体组织中表达的差异性变化。为研究文昌鱼HSP90基因的结构及其进化、该基因在文昌鱼免疫过程中的作用提供了一系列实验依据。
本文利用RT-PCR的方法,克隆得到的AmphiHSP90148lbp,编码493个氨基酸组成的蛋白。该蛋白片段在氨基酸水平上与黑猩猩、鼠(大鼠和小鼠)、鸡、爪蟾、斑马鱼、果蝇等的HSP90蛋白的相似性为80%-85%,且具有典型的HSP90保守结构域。
经过系统进化分析发现,AmphiHSP90介于脊椎动物和无脊椎动物HSP90蛋白之间说明该基因的进化地位与文昌鱼的进化地位是基本上一致的。
组织原位杂交的结果表明,AmphiHSP90在文昌鱼成体组织中广泛表达(包括表皮、鳃丝、肠上皮、精巢膜和卵巢膜),而免疫组织化学结果表明HSP90在文昌鱼体内表达则大量在肌肉和鳃柱中表达,少量在表皮中表达,AmphiHSP90这种蛋白表达模式与基因表达模式的不一致性可能有两个原因:其一是肌肉内有丰富的HSP90,可能与HSP在肌细胞内行使分子伴侣的角色有关,HSP可与肌动蛋白、微管蛋白和酪氨酸激酶等结合,参与细胞最基本的代谢活动;各种上皮组织中HSP的mRNA表达丰富,可能与HSP90蛋白分泌有关。其二,使用异源性抗体的可信度较低造成的。蛋白表达的真实性有待于进一步的研究证实。
利用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对文昌鱼进行免疫冲击,采用半定量RT-PCR的方法检测AmphiHSP90基因水平表达量的变化,结果发现,无论是经大肠杆菌还是金黄色葡萄球菌冲击后,对照组ArnphiHSP90基因的表达量没有明显的变化;而实验组AmphiHSP90基因的表达量均明显上调,推测AmphiHSP90在文昌鱼抵抗外界细菌的侵染时,可能起到防护的作用。